李玲研究组2004研究工作总结和未来三年工作计划_工作总结和工作计划
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李玲研究组2004-2009年研究工作总结和未来三年工作计划
研究方向：植物次生代谢与调控
成员：李玲、洪岚、胡博、刘旭、周文灵、张碧玉、苏良辰、姚瑶、吕旻、赖艳艳
主要研究进展简介：
1.脱落酸提高花生抗旱分子生理机理研究；
从耐旱花生品种中克隆 AhNCED1基因和AhAO1基因，促进旱胁迫下ABA生物合成的功能，异源表达的转基因拟南芥植株，降低其对水分胁迫的敏感性，将AhNCED1基因转移到干旱敏感花生品种汕优523，使该基因和蛋白在水分胁迫下超表达，与ABA水平的提高一致。花生耐旱品种在干旱胁迫下，营养器官 AhNCED1基因和AhNCED1蛋白表达明显高于敏感品种，与内源ABA含量增加一致，叶片脱水处理1 h，AhNCED1基因和蛋白表达增强，说明花生叶片对水分胁迫下ABA的生物合成是敏感的早期事件。2008年获得了花生AhNCED1 基因ATG上游的启动子序列，发现序列片段中含有多个ABRE，在转基因拟南芥中表达其活性，水分胁迫、ABA处理均提高其活性。AhNCED1 基因ATG上游的启动子序列与拟南芥同源基因AtNCED3基因的启动子在结构有差异，后者具有ABRE以及DRE。在此基础上从花生中从克隆了AhAREB基因，证实其编码AhAREB蛋白，受干旱和ABA诱导。
将AhNCED1 基因转化花生敏感品种汕优523，抗性芽发生率为100%，存活的抗性芽平均数为1.67。经400 mg L-1 卡那霉素筛选后，48.3%植株PCR 检测阳性，GUS 检测和Southern 杂交阳性率分别为50 %和83.3 %。已经将反义AhNCED1 融合载体转化花生耐旱品种粤油7 号，获得了拟转基因的花生植株，目前正在对拟转基因植株进行生化鉴定和扩大繁殖。随机抽取的抗性拟转基因植株，其中7 株PCR 具阳性
2.葛根素形成相关基因克隆和代谢调控研究
从野葛根中克隆葡糖基转移酶基因PlUGT1和PlUGT2，在野葛的根和叶均有表达，具有葡糖基转移酶保守的PSPG-box 蛋白序列，构建毕赤酵母分泌型表达载体，在毕赤酵母表达系统中表达目的基因PlUGT产物，目前正在证实目的蛋白是否具有催化合成葛根素功能。
建立了从野葛中提取葛根素和用反相-HPLC方法测定C-葡糖基转移酶活性的方法： 用5 mmol/L Tris-HCl（pH 8.1）与材料比3：1提取葛根素，80%和100%硫酸铵沉淀蛋白，酶反应的最佳体系为：35.5 μmol/L异甘草素，112 μmol/L UDP-G，0.1 μmol/L Tris-Hcl缓冲液（pH8.1，含5 mmol/L DTT）和蛋白浓缩液，反应总体积为220 μl，28℃1h后加入10 μl冰乙酸终止反应。用LC-20AT日本岛津高效液相色谱仪；色谱条件：色谱柱：YMC-Pack ODS-A(4.6*250 mm，5μm)；波长254nm；流动相：甲醇：水=70：30；流速：1mL/min；柱温为30℃；进样量10 μl。在0.15－1.3 ug /ul葛根素含量与葛根素峰面积线性关系良好（R2 = 0.9986）。
根据葛根素和大豆甙元在凝胶系统下有较强亮斑的特性，建立了薄层层析法初步鉴定糖基转移酶的性质。相同浓度下葛根素在波长250nm处有较强的吸收峰，而异甘草素有两个吸收峰，分别在250nm和 370 nm处。
3.花卉组织培养中外植体褐变发生机理研究。
蝴蝶兰叶片外植体在MS、B5 和N6 培养基外植体褐变过程中PPO活性增加。50mg/L抗坏血酸和100mg/L硫代硫酸钠浸泡外植体10min，对外植体的褐变有抑制效果。褐变叶片外植体的上表皮变形,维管束破坏,被鞣质填充,褐变外植体分泌到培养基中有鞣质成分。外植体在褐变初期，体内鞣质含量递减，培养第8d到12 d，鞣质含量迅速升高；用0.3 mg/L儿茶素处理外植体，其褐变程度、褐变率和体内鞣质含量明显增加。
褐变的外植体维管束内分布高活性PPO，总酚含量和PAL活力随褐变的加重而增加。外植体离体培养第3天PAL基因表达明显提高，外植体褐变加重，PAL表达水平降低。在Fe盐加倍培养基中培养的蝴蝶兰叶片外植体的PAL mRNA表达量高于对照；比对照早一天出现明显增加，随后表达维持较高水平。
获得蝴蝶兰PPOcDNA全长（PhPPO），获得PPO重组质粒，转化大肠杆菌BL21，0.制备了抗体。克隆蝴蝶兰过氧化物酶家族的ClaⅠ和Ⅲ类的POD（APX和POX）基因（分别命名为PhAPX和PhPOD），分别具有ClaⅠ和Ⅲ类的POD家族的特点。为Western blot 方法检测蝴蝶兰叶外植体PPO蛋白变化提供基础。
主持的科研课题：
1.花生抗旱相关AhABRE类转录因子的功能研究。国家自然科学基金面上项目（30971715）。2010-2012 32万元
2.花生抗性相关NAC转录因子的功能研究（9***0001）。广东省自然科学基金项目。2009-2010
5万元 3.野葛C-葡糖基转移酶基因在毕赤酵母中的表达及在葛根素生成的应用研究(2009B020301003)，广东省科技计划项目，2009-2011，8万元。
4.脱落酸调控花生侧根发生机制研究（8***0011）。广东省自然科学基金项目。2008-2010 5万元
5．花生脱落酸合成关键酶基因AhNCED1在干旱胁迫中的功能研究（30771297）。国家自然科学基金面上项目。2008-2010
30万元
6.AhNCED1蛋白功能与结构研究（06Z009）。广东省教育厅自然科学重点项目。2007-2009，12万元
7.花生抗旱基因高效转化技术研究（2006B20101002）。广东省科学事业费计划项目，2006-2008，7万元
8.干旱 胁 迫 下花生抗旱基因AhNCED1的表达分析(06025049)，广东省自然科学基金项目，2006-2009.5万元
9.野葛C-葡糖基转移酶克隆及在毕赤酵母中表达研究（04010337）。广东省自然科学基金项目。2005-2006，5万元
9.蝴蝶兰离体培养褐变抑制剂的研制与开发（2005B20901019）。广东省科学事业费计划项目。2005-2008，10万元
10.蝴蝶兰离体培养褐变分子生物学研究(05300272)。广东省自然科学基金项目，2005-2007，2万元
发表的相关论文：
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(Spurflowers)as New Flowering Pot Plants，Acta Horticulture（ISTP）, 774，437-442 Chen, G.L.L1, 2007,Nutrient consumption and production of isoflavones in bioreactor cultures of Pueraria lobata(Willd.).Journal of Environmental Biology.，28（2）:321-326 Rui-Fang Tan, Jun Tao, Ling Li, 2007，Genetic Transformation of Ipomoea purpurea Mediated by Agrobacterium rhizogenes.Floriculture and Ornamental Biotechnology 1(2): 131-135 Jun Tao, Ling Li, 2006, Genetic Transformation of Torenia fournieri L.Mediated by Agrobacterium rhizogenes.South Africa Journal of Botany。72：211-216
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获得专利：
王利国、李玲，兰花炭疽病的防治方法200510121283.6。授权公告日2008年6月4日 陈刚、李玲，含羞草的繁殖方法ZL 200410051960.7，授权公告日2006年10月3日
刘吉升、谭武贤、陈刚、李玲，黄虾花的繁殖方法ZL200510037068.8，授权公告日2007年10月3日
谭武贤、刘吉升、陈刚、李玲。非洲澎蜞菊的繁殖方法。ZL 2004 1 0077597.6，授权公告日2006年11月22日。
近期研究工作：
1.转录因子AhNAC2 和AhAREB在花生响应ABA调控的作用
探讨花生在水分胁迫处理下以及对水分胁迫敏感的发育时期AhAREB 转录因子的表达特性和定位，明确AhAREB 转录因子的转录活性、激活区域，分析AhAREB 基因超表达和反义RNA 表达的花生植株在水分胁迫下相关基因的表达和抗旱性，通过对拟南芥异源表达恢复同源基因突变体abi5 的表型及生理功能分析，为全面认识AhAREB的功能提供依据。
以模式植物拟南芥为材料，认识转录因子AhNAC2和AhAREB对ABA不敏感突变体和NAC同源基因缺失突变体表型的恢复作用，以及对ABA诱导的相关基因表达分析，研究转录因子AhNAC2和AhAREB与AhNCED1的特异结合，认识两者参与调控ABA作用的作用途径及相互关系。为了解花生接受干旱信号到脱落酸合成基因诱导表达期间的信号传导提供基础。
2.野葛葡糖基转移酶基因在毕赤酵母中的表达及合成葛根素研究
探讨重组酵母菌培养过程中，对培养基成分、温度、pH、培养时间以及底物配比等适宜条件；通过筛选酵母菌种、高拷贝重组酵母以及表达目的蛋白的适宜条件，建立产生高含量葛根素的体系。从培养液中提取纯化葛根素，分析其含量和纯度，用肿瘤HeLa细胞凋亡以及小鼠降血脂等研究葛根素的效果。
3.PPO在蝴蝶兰叶片外植体褐变发生的作用
深入探讨PPO在蝴蝶兰叶片外植体褐变发生的作用和细胞分子生物学机理，了解蝴蝶兰叶外植体褐变发生早期，PPO活性变化和细胞内分布与鞣质含量和分布的关系。认识外植体褐变发生时期PPO基因表达、PPO蛋白表达和量的变化，明确PPO在外植体褐变中是否存在基因水平和蛋白水平上的调控，明确外植体褐变发生中PPO的作用。为认识蝴蝶兰叶外植体组织培养过程中褐变发生的分子机理提供基础。
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