固定化酶在现代工业中的应用_酶的固定化及其应用
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固定化酶在现代工业中的应用
姓名：胡艳芬 学号：2008132106 指导教师：张孟
摘要
酶是一类有催化功能的蛋白质,具有反应条件温和, 底物专一性强, 可在水溶液和中性pH 下操作等优点。与游离酶相比，固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时，又克服了游离酶的不足之处。本文简要介绍了固定化酶的概念、制备方法及其在生物、医药、环境保护等方面的广泛应用。重点介绍一些固定化酶在现代工业中的应用，并对其应用前景进行了展望。
关键词
固定化酶 制备 工业 应用 前景
酶是一类由活细胞产生的具有生物催化功能的分子量适中的蛋白质,具有极高的催化效率、高度的特异性及控制的灵敏性。大多数酶是水溶性的。由于酶催化反应具有底物专一性、催化高效性、反应条件温和等优点,符合绿色化学的要求,从而被大家高度重视,已在许多领域得到广泛的应用。酶的最大缺点是其不稳定性,在酸、碱、热及有机溶剂中易发生变性,活性降低或丧失;而且酶反应后,会在溶液中残留,造成酶反应难以连续化、自动化,同时也不利于终产品的分离提纯,这些都大大阻碍了酶工业的发展,所以有必要采取酶工程技术改善这些缺点。酶工程技术措施较多,其中酶的固定化技术是重要举措之一。酶的固定化是用人工方法把从生物体内提取出来的酶固定在特定的载体上或使酶与酶相交联,酶被限定在一定区域内,但仍保持原有高效、专
一、条件温和的催化功能。
已固定化的酶像化学反应所用的固体催化剂那样, 既能发挥它们的催化特性, 又能回收, 并能多次反复使用, 使整个生产工艺可以连续化、自动化。近年来, 国内外科技工作者在固定化酶在工业生产中的应用做了大量研究，并得到了广泛的发展，本文将对这些成就做具体介绍。固定化酶的概念
1916 年Nelson 和Griffin 最先发现了酶的固定化现象后, 科学家就开始了固定化酶的研究工作。1969 年日本一家制药公司第1 次将固定化的酰化氨基酸水解酶用来从混合氨基酸中生产L-氨基酸, 开辟了固定化酶工业化应用的新纪元。酶的固定化是用人工方法把从生物体内提取出来的酶固定在特定的载体上或使酶与酶相交联,酶被限定在一定区域内,但仍保持原有高效、专
一、条件温和的催化功能。通常酶是游离的,而经过固定化以后,酶被束缚在一定区域内,因而这样的酶被称为固定化酶
[ 3, 4 ]
[2][1]
。与游离酶相比, 固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时, 又克服了游离酶的不足, 呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续可控、工艺简便等一系列优点。固定化酶的制备
酶的固定化(enzyme immob ilization)是指采用有机或无机固体材料作为载体(carrier or support),将酶包埋起来或束缚、限制于载体的表面和微孔中, 使其仍具有催化活性, 并可回收及重复使用的酶化学方法与技术。固定化酶的制备方法有物理法和化学法两大类。物理方法包括物理吸附法、包埋法等。物理法固定酶的优点在于酶不参加化学反应,整体结构保持不变,酶的催化活性得到很好保留。化学法是将酶通过化学键连接到天然的或合成的高分子载体上,使用偶联剂通过酶表面的基团将酶交联起来,而形成相对分子量更大、不溶性的固定化酶的方法。
2.1 传统的酶固定化方法
传统的酶固定化方法大致可分为4 类: 吸附法、交联法、包埋法、共价结合法。吸附法是最早出现的酶固定化方法, 包括物理吸附和离子交换吸附。该法条件温和, 酶的构象变化较小或基本不变, 因此对酶的催化活性影响小, 但酶和载体之间结合力弱, 在不适pH、高盐浓度、高温等条件下, 酶易从载体脱落并污染催化反应产物等。交联法是利用双功能或多功能交联试剂, 在酶分子和交联试剂之间形成共价键, 采用不同的交联条件和在交联体系中添加不同的材料, 可以产生物理性质各异的固定化酶。交联法一般作为其它固定化方法的辅助手段。包埋法的基本原理是载体与酶溶液混合后, 借助引发剂进行聚合反应, 通过物理作用将酶限定在载体的网格中, 从而实现酶固定化的方法。该法不涉及酶的构象及酶分子的化学变化, 反应条件温和, 因而酶活力回收率较高。包埋法固定化酶易漏失, 常存在扩散限制等问题, 催化反应受传质阻力的影响, 不宜催化大分子底物的反应。载体偶联法是指酶分子的非必须基团与载体表面的活性功能基团通过形成化学共价健实现不可逆结合的酶固定方法, 又称共价结合法。载体偶联法所得的固定化酶与载体连接牢固, 有良好的稳定性及重复使用性,成为目前研究最为活跃的一类酶固定化方法。但该法较其它固定方法反应剧烈, 固定化酶活性损失更加严重。2.2 传统固定化技术的改进
保持各种传统固定化方法的优点并改进其不足一直是固定化酶方面研究的重要内容。改善酶固定化效果的途径有: 改善表面积以及孔径等物理结构,如采用分子筛或纳米纤维微孔膜;改善化学交联的反应及方式, 如辐照, 引发剂引发等;改善结合的方向选择性, 如采用定向固定化的方法;其他手段, 如利用长臂使酶远离载体表面, 使载体-酶体系的溶解度随温度、pH 值等条件的改变而改变, 以便于产物的分离及酶的回收。针对不同的酶有不[5]同的策略, 对于某些酶可能取向很重要, 而对于其他酶可能载体造成的环境重要一些, 因此, 每种酶固定的最佳条件目前还是特异的, 没有统一的理论, 其原因可能是相互间的影响因素太多, 而酶又多由具有复杂组成和空间构型的蛋白质构成, 不存在明显的因果联系。今后可望建立起适用的模型, 使用计算机得到最优的固定策略。2.3 新型酶固定化方法
开发新型酶固定化方法的原则是: 实现在较为温和的条件下进行酶的固定化, 尽量减少或避免酶活力的损失。通过辐射、光、等离子体、电子等新方法均可制备高活性固定化酶。Mohy 等[ 6] 以137 Cs 为辐射源,通过C2射线引发将甲基丙烯酸甲酯接枝共聚于尼龙膜表面, 经进一步活化, 用于青霉素酰化酶的固定。光偶联法是以光敏性单体聚合物包埋固定化酶或带光敏性基团的载体共价固定化酶, 由于条件温和, 可获得酶活力较高的固定化酶。Li等 利用含芳香叠氮基的光活性酯, 在远紫外光辐照下, 叠氮基光解生成氮烯与PES 膜表面的C-H 键间发生插入反应形成仲胺, 将脲酶共价键合到PES 膜的表面。等离子体是高度激发的原子、分子、离子以及自由基的聚集体, 大量的等离子体常在室温下存在。载体材料表面可以由等离子体进行有用修饰
[ 8, 9]
[ 7], 从而引入活性基团。Puleo 等将钛合金T i26Al24V 表面用丙烯酸胺等离子体处理引入氨基, 然后将含碳硝化甘油接枝于钛合金表面, 或者将等离子体处理的钛合金先由琥珀酸酐处理, 再用含碳硝化甘油接枝, 进而将溶菌酶和骨形态蛋白进行固定, 实现了生物分子在生物惰性金属上的固定化。固定化酶在现代工业中的应用
3.1 酶蛋白工程在工业酶中的应用
目前酶蛋白质工程主要集中在工业用酶的改造, 因为工业用酶有较好的酶学和晶体学研究基础, 酶的发酵技术(包括诱变技术和筛选方法)也比较成熟, 而且其微生物的遗传工程发展较好, 其次工业酶无须进行医学鉴定, 能很快地投入使用.如用作洗衣粉添加酶的枯草杆菌蛋白酶, 是一种天然的丝氨酸蛋白酶, 它能够分解蛋白质, 使衣服上的血迹和汗渍等很容易洗掉.但这种酶一般比较脆弱, 在漂白剂的作用下容易被破坏而失去活性, 原因是222位的甲硫氨酸容易被氧化成砜或亚砜.现在利用蛋白质工程技术, 用丝氨酸或丙氨酸替代后, 酶的抗氧化能力大大提高, 可在0.5mol/L 的过氧化氢溶液中停留1小时而活性丝毫未损, 这样便可与漂白剂混合使用.可以预见生物工程技术的发展和酶固定化技术可以相互补充, 共同发展对酶在工业领域的应用必将起到更大的推动作用。3.2 固定化酶在食品工业中的应用
酶固定化在食品工业中的应用是早期发展起来的一个传统领域.其中最有名的, 也是规模最大的过程, 就是采用固定化葡萄糖异构酶, 从葡萄糖生产高果糖浆.其它还包括采用固定化乳糖酶去除牛乳中的乳糖、采用固定化脂肪酶通过转酶反应生产可可油替代品、采用固定化耐热蛋白酶制造甜味剂2天冬甜精, 以及应用固定化L2天冬酶从富马酸铵生产天冬氨酸等[ 7]。1973 年,日本用聚丙烯酸酰胺为载体,用包埋法制成固定化天冬氨酸酶,用于工业化生产。固定化乳糖酶和固定化天门冬氨酸-β-脱羧酶分别于1977 年和1982 年用于工业化生产。
3.2.1 固定化酶在乳制品生产中的应用
牛奶中含有一定量的乳糖,有些人体内缺乏乳糖酶,在饮用牛奶后常出现腹泻、腹胀等症状;另外,由于乳糖难溶于水,常在炼乳、冰淇淋中呈沙样结晶析出,影响风味。乳糖酶可将乳糖分解为半乳糖和葡萄糖,如将牛奶用乳糖酶处理则可解决上述问题。Fernandes等[ 6 ]研究用琼脂糖作载体,固定来源于南极的冷适应菌Pseudoalterom onas sp的β-半乳糖苷酶,并应用于牛奶中乳糖的降解,生产低乳糖牛奶;Caterina等[ 7 ]运用固定化技术,研究牛奶中碱性磷酸酶的耐热性;Mona等[ 8 ]研究用离子吸附法固定来源于B acillus licheniform is 5A1的牛奶凝结酶,并用于干酪生产。
3.2.2 固定化酶在啤酒生产中应用
在啤酒生产中,需添加外源性的淀粉酶来补充天然酶的不足。此外,长期放置的啤酒会由于多肽和多酚物质发生聚合反应而变得混浊,为防止出现混浊,目前主要采用添加蛋白酶来水解啤酒中的蛋白质和多肽。温燕梅等以化学共沉淀法制得的磁性聚乙二醇胶体粒子为载体,固定胰蛋白酶,该磁性酶对啤酒澄清、防止冷浑浊有明显效果;Stepanova等研究用DEAE-纤维素固定β-葡萄糖苷酶和多聚半乳糖醛酸酶,用于樱桃、李子的果酒生产。3.2.3 固定化酶在茶饮料生产中的应用
将固定化酶法应用于茶饮料生产中,可去除异味,提高适口性,提高营养价值。李平等
[ 9 ]
研究从黑曲霉(Aspergillus niger)发酵液中提取β-葡萄糖苷酶酶液,用丝素蛋白将其固定,此固定化酶可应用于茶汁的风味改良;苏二正
[10 ]
等以海藻酸钠为载体,采用交联-包埋-交联的方法共固定化了单宁酶和β-葡萄糖苷酶,可应用于茶饮料的除浑和增香处理。3.3 固定化酶在化工领域中的应用。
水解蛋白酶固定化后可用于肽及有机化合物的酶促合成,如硅藻土固定化木瓜蛋白酶可在乙酸乙酯介质中催化合成LeuPhe-LeuLL231 [ 3 ] 彭志英1 食品酶学导论[M ] 1 北京: 中国轻工业出版社, 20021 [ 4 ] 罗贵民,曹淑桂,张今1酶工程[M ] 1北京:化学工业出版社, 2002 [ 5 ] 杨昌英, 潘家荣, 钟珩等.醋酸纤维素固定化脂肪酶催化猪油合成单甘酯[ J ].湖北化工, 2002,(6): 20 21.[ 6 ] Mohy M Y, Ben civenga U, Roi S, et al.Charact erizat ion theact ivity of pen icillin G acyl as e immobilized on to nylon membranesgraft ed with different acrylic monomers by means of C2radiation[ J].J ou rnal of Molecular Cat alysis B: E nzymat ic, 2000: 2332 244.[ 7 ]吴国琪,凌达仁,王忱,等.固定化谷氨酸脱羧酶性能的研究[J ].离子交换与吸 附,1999 ,15(1):71.[ 8 ] Mona A E, Yannick C B1 Immobilization of Bacilluslicheniformis 5A1 milk-clotting enzyme and characterization of itsenzyme p roperties [ J ] 1 World Journal of Microbiology andBiotechnology, 2006, 22(3): 197～2001 [ 9 ] Kalia V , Goyal L , Pundir C S.烷基胺玻璃固定化葡萄糖氧化酶测定血糖[J ].生物工程学报, 1998 , 14(3): 336.[ 10 ] 徐晖,王燕,魏密苏.环境工程中固定化酶与固定化微生物的应用[J ].沧州师范专科学校学报,2002 ,18(3):42.[ 11 ] Dinelli D.Proce Biochem [ J ].Proce Bio chem, 1972, 7(8): 9 14.[ 12 ] 岳振峰, 彭志英, 徐建祥等.壳聚糖固定化葡萄糖苷酶的研究[ J ].食品与发酵工业, 2001, 27(4): 20 24.[ 13 ] 陈雄.固定化糖化酶的研究[ J ].中国酿造, 2001,(2):19 20.[ 14 ] 唐芳琼, 孟宪伟, 陈东, 冉均国, 苟立, 郑昌琼.纳米颗粒增强的葡萄糖生物传感器[ J ] , 中国科学B 辑, 2000,30(2): 119 124.[ 15 ] 马秀玲,陈盛,黄丽梅,等.磁性固定化酶处理含酚废水的研究[J ].广州化学，2003,28(1):17
Immobilized in the modern industrial application
Name: Hu Yanfen
Instructor: ZhangMeng
Abstract Enzymes are a cla of proteins with catalytic function, with mild reaction conditions, substrate specificity, and can be in aqueous solution and neutral pH operation, etc..Compared with free enzyme, immobilized enzyme while maintaining its high specificity and moderate catalytic properties of enzymes, they also overcome the inadequacies of the free enzyme.This paper introduces the concept of the immobilized enzyme, preparation methods and in biology, medicine, environmental protection and other aspects of the wide range of applications.Highlights some of the immobilized enzyme applications in modern industry, and its application prospect.Key words
Immobilized Preparation Industry Application foreground
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