SDSPAGE赵_sdspage操作方法

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SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的相对分子质量

一、实验目的学习SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本操作过程，掌握SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质相对分子量的原理。

二、实验原理

SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）是对蛋白质进行量化、比较及特性鉴定的一种经济、快速，而且可重复的方法。通常在电泳分离时，其迁移率主要取决于蛋白质本身所带电荷的多少、分子量大小和形态，但如在PAGE系统中加入阴离子去污剂SDS，蛋白质分子的电泳迁移率主要取决于它的分子量大小，而与其所带电荷多少和形状无关，因此，常用SDS-PAGE测定蛋白质分子量。

SDS是十二烷基硫酸钠的简称，它是一种阴离子去污剂，它能按一定比例与蛋白质分子结合成带负电荷的复合物，其负电荷远远超过了蛋白质原有的电荷，也就消除或降低了不同蛋白质之间原有的电荷差别，这样使电泳迁移率只取决于分子大小这一个因素，就可根据标准蛋白的相对分子质量计算待测（或未知）蛋白质的相对分子质量。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE）有圆盘电泳、管状电泳和垂直板电泳等。垂直板电泳的胶是指在两层支持的玻璃板之间形成的薄片状凝胶。由于薄片胶可在同一块胶上跑很多样品，使聚合、染色、脱色具有一致性，所以垂直板电流比其他电泳应用的更为广泛。本实验用目前常用的垂直平板电泳。

在凝胶电泳中使用丙烯酰胺梯度胶比使用线性胶有两大优点。一是在高浓度丙烯酰胺条件下可以增加蛋白质的分子筛作用，从而使低分子量蛋白形成清晰的条带。另一是梯度胶可以在一块胶内分离分子量范围更大的蛋白质（如5%~20%的凝胶可以在一块胶内分离15kDa~200kDa的蛋白质）。丙烯酰胺在梯度胶中的百分比可根据需要来定。

三、仪器、材料及试剂

(一)仪器

1．冷冻离心机

2．冰箱：-20℃、-80℃

3．垂直板凝胶电泳仪（BIO-RAD公司）

4．垂直平板电泳槽

5．2D-9556A数显水平脱色摇床（太仓市科教器材厂）

6．移液枪（1.0mL、200L、20L）

7．微量注射器（20L）

（二）材料及试剂

1．待测蛋白样品

2．磷酸盐缓冲液（PBS，0.01mol/L, pH7.2）

3．丙烯酰胺（Acr）和甲叉双丙烯酰胺（Bis）溶液（凝胶储备液）：称取Acr 29.2g，Bis 0.8g，加重蒸水至100mL，微孔（直径0.22m）滤膜过滤后存于棕色试剂瓶中，于4℃保存，30天以内可以使用。

4．10%SDS：称取SDS 10g，加水至100mL。

5．1.5M Tris-HCl（pH8.8）：称取Tris（三羟甲基氨基甲烷）18.15g，用60mL重蒸水溶解，再用1.0mol/L HCl调pH至8.8，定容至100mL，4℃冰箱保存。

6．0.5M Tris-HCl（pH6.8）：称取Tris 6.06g，用60mL重蒸水溶解，再用1.0 mol/L HCl 调pH至6.8，定容至100mL，4℃冰箱保存。

7．10%过硫酸铵（AP）：称取过硫酸铵0.1g，加水至1mL，现配现用，4℃保存。8．10×电泳缓冲液：秤取Tris 30g，甘氨酸144g，SDS 10g，定容至1000mL，4℃保存。9．5×样品缓冲液：称取蔗糖5g（或甘油5mL），加入10%SDS 2.0mL，溴酚蓝10mg，0.5M Tris-HCl(pH6.8)1.2mL，-巯基乙醇0.5mL，加水定容至10mL。

10．染色液：称取考马斯亮蓝R250 2.0g，加入甲醇450mL，冰乙酸100mL，加水450 mL。11．脱色液：甲醇100mL(5-50%浓度越高，脱色越快，温度高也快，可在37℃)，冰乙酸100mL，加水800mL。(甲醇200mL, 冰乙酸100mL，加水700mL。)

12．低相对分子质量标准蛋白质（上海产），开封后溶于200 mL重蒸水，加200 L 2倍样品缓冲液（还原缓冲液），分装20小管，-20℃保存。临用前沸水浴3-5分钟。其相对分子质量如下：

标准蛋白质Mr 兔磷酸化酶B97400 牛血清蛋白66200 兔肌动蛋白43000 牛碳酸酐酶31000 胰蛋白酶抑制剂20100 鸡蛋清溶菌酶14400

13．烧杯、直尺。

四、实验步骤

1．分离胶制备

（1）准备好凝胶模具，根据所需要分离的蛋白质分子量选择10％的分离胶用于实验，分离胶储备液见表1，配置0.75mm厚、10×7㎝的凝胶。准备好未加TEMED的分离胶，将TEMED加至分离胶溶液内，轻轻搅拌混匀，立即准备灌制凝胶。注意动作要迅速，因为凝胶很快会聚合。

（2）缓慢地将分离胶注入已经固定在夹心垂直平板电泳槽里的狭槽中，注意在本操作中不能产生任何气泡。然后尽快地在分离胶的上面轻轻地覆盖一层水。

（3）凝胶置于室温下10～15min，使凝胶聚合完全。当聚合完全后，则在水相和凝胶的交界处有一明显的亮线。除去上层水相后，准备灌制浓缩胶。

2．浓缩胶制备

采用5%的浓缩胶进行电泳，制备浓缩胶所需的储备液体见表1。将制备好的浓缩胶慢慢地灌进狭槽中，然后将所需的样品梳插入夹心槽的上部，并上下轻轻拉动梳子，小心地去除粘附在梳齿顶部的小气泡待聚合完全后（约30min）即可拔去梳子，准备电泳。

3．样品制备

将4L蛋白样品和1L的5X样品缓冲液混合后置于eppendorf管中，于沸水中加热5min后立即放入冰浴中，使蛋白质变性。

4．加样

先将样品梳子移去，用双蒸水淋洗每个样品孔，然后用微量注射器在样品孔中加入电泳缓冲液，同时在电泳槽中也加满电泳缓冲液。用微量加样器将样品加入样品孔，每孔5～10μL。

5．电泳

连接电源，打开电泳仪电源开关，调节电流至20-30mA并保持电流强度恒定，在室温下进行电泳。待蓝色的溴酚蓝条带迁移至距凝胶下端约1cm时，停止电泳。

6．染色

将凝胶浸入装有染色液的塑料盒中，在溴酚蓝条带的中心插一细钢丝作为标志，在25℃恒温摇床上染色0.5-1h。

7．脱色

倒出染色液，用蒸馏水洗去凝胶表面的染料，加入脱色液，于摇床中脱色2～3次，每次脱色0.5-1h，至背景清晰为止。

表1 分离胶和5％浓缩胶的配制

成分

5％

1.5M Tris-HCl pH8.8(mL)0.5M Tris-HCl pH6.8(mL)

10%SDS(L)凝胶储备液(mL)Mili-Q水(mL)10%过硫酸铵(L)TEMED(L)总体积(mL)

2.5100 1.67 5.68 50 5 10

7.5% 2.5100 2.5 4.85 50 5 10

分离胶 10% 2.5100 3.33 4.02 50 5 10

12% 2.5100 4.0 3.35 50 5 10

15% 2.5100 5.0 2.35 50 5 10

20% 2.5100 6.67 0.68 50 5 10

浓缩胶 5％1.0 40 0.67 2.26 25 3 4

五、实验数据处理

1．用直尺分别量出标准蛋白质、待测蛋白质区带以及钢丝距分离胶顶端的距离，按以下公式计算相对迁移率：

相对迁移率=样品迁移距离/染料迁移距离

2．以标准蛋白质M的对数对相对迁移率作图，得到标准曲线。根据待测蛋白质样品的相对迁移率，从标准曲线上查其相对分子质量。

六、思考题

1．SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳除用于测定蛋白质相对分子质量外，还有何用途？ 2．电泳过程中，为什么要加入溴酚蓝，其作用是什么？ 3．当分离较小分子量的蛋白质时，应如何控制胶的浓度？