分子生物学_分子生物学内容
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分子生物技术在微生物鉴定中的应用
摘要：微生物多样性是生物多样性的重要组成部分。由于微生物和 动、植物 相比, 存在着多种显著差异。而传统的基于微生物培养与纯种分离的技术具有很大的局限性，分子生物学及其有关技术的长足进展及其在为生物中的使用, 使微生物的研究进入了分子的阶段。
关键词：16SrDNA PCR 温度梯度电泳 变性梯度凝胶电泳 微生物包括了从原核到真核的不同类群的生物: 细菌、放线菌、原生动物、真菌、部分藻类和病毒, 是生物多样性的重要组成部分。此外, 微生物多样性与其他生物类群相比有许多独特之处, 包括: 1)生存环境多样;2)生长、繁殖速度多样;3)营养、代谢类型多样;4)生活方式多样。因而, 微生物多样性的研究无论对于生态系统功能的完整理解, 还是对于微生物资源的利用和开发都具有特殊重要的意义[1]。微生物作为生态系统中极重要的一员, 对动植物的生长，生态系统中的能流和物质循环及环境污染物的降解和解毒等方面起着重要作用并且与人的生活健康息息相关。随着微生物的不断发现及研究，传统微生物技术越来越不能满足其发展的需要，最主要的不足是丢失了微生物的多样性, 许多报道都指出, 在自然环境中有相当多的菌种(约90%-99%)用传统方法无法培养出来[2].这对于微生物基因组学研究来说是很不利的.，导致研究的片面性并且效率低下。而分子生物学技术则避开了传统微生物培养分离的环节, 而是采取直接从样品中抽取所含微生物总DNA, 然后通过16S rDNA, PCR, RAPD, DGGE
和RFLP 等多种分子生物学研究手段, 对直接提取的总DNA进行分析, 了解其中所包含的微生物DNA 的种类和含量, 以研究样品中微生物的实际组成, 同时可以利用直接提取得到的总DNA 建立基因文库, 并从中筛选有用的基因。由于是直接从样品中提取总DNA, 中间没有任何筛选性的过程, 因此, 所得DNA 能够准确地反映样品中微生物的实际情况, 避免了传统培养方法不能真实反映微生态实际情况的缺点, 也不会丢失样品中存在的任何微生物,同时, 这种方法能够很容易、大批量地取得同一环境下乃至不同环境下的不同微生物的同源基因, 为微生物比较基因组学研究开辟了道路.此外, 用直接提取的总DNA 构建的基因文库, 包含了大量以前因为无法培养而不能获得的微生物基因, 从这些文库中发现全新的具有巨大应用价值的抗生素类、酶类及其他生物活性物质的基因应该是非常有潜力的。1．16SrRNA比较测序
16SrDNA是编码原核生物16SrRNA的基因，长度约1500bp，存在于所有的原核生物的基因组中，由多个保守区和与之相间的多个可变区组成。保守区为所有细菌共有，细菌之间无显著差异；可变区在不同细菌之间存在一定程度的差异，具有细菌属或种特异[3]。2.PCR 近年来,对环境样品总DNA 进行PCR 扩增, 推动了利用分子标记技术研究微生物的多样性。PCR技术是美国letus公司人类遗传研究室的科学家与1983年发明的一种在体外快速扩增特异基因或DNA 序列的方法, 其目的是将极微量DNA大量扩增。该技术模仿生物体内DNA的复制过程,首先使DNA 变性, 两条链解开;然后使引物模板退火, 二者碱基配对;耐高温的Taq DNA 聚合酶以4种dNTP为底物, 在引物的引导下合成与模板链互补的DNA 新链[4]。PCR 技术可在体外快速扩增DNA, 具有快速、简便、灵敏度高的特点。当然常规 PCR技术也存在很多的问题，如出现假阳性、形成引物二聚体、传统的PCR技术一次扩增只能检测一种微生物、RNA病毒的PCR检测操作繁琐，中间污染环节多，易出现假阳性或假阴性结果等.为了弥补上面这些不足，一些新的PCR技术逐渐衍生出来并被用于实践，如热启动PCR、巢式PCR、逆转录PCR、多重PCR、通用引物PCR、PCR单链构象多态性分析、随机引物DNA 多态性扩增（RAPD）、限制性长度多态性分析（RFLP）、实时荧光PCR（real-time PCR）等[5]。3.电泳分离及其显示方法
除过我们熟知的琼脂糖凝胶电泳并用溴乙锭(EB)染色方法和聚丙烯酰氨凝胶电泳(PAGE 分离)银染方法外, 还有一些通过特殊的电泳分离技术而建立的分子标记, 如变性梯度凝胶电泳(DGGE), 可分离长度相同但是序列不同的DNA 片段的混合物。对于特异性引物PCR 扩增的环境微生物的16SrRNA 基因, 一般的电泳很难将序列不同的片段分开。DGGE胶在聚丙烯酰氨胶中添加了线性梯度的变性剂, 可以形成从低到高的线性梯度, 在一定温度下, 同一浓度的变性剂中, 不同序列的产物，其部分解链程度不同。DNA 解链程度不同决定其电泳的迁移率, 结果不同的产物在凝胶上分离开。在变性条件适当的情况下, 该技术能分辨一个碱基对。DGGE 技术在微生物群落结构的研究、微生物种群的动态分析、富集培养以及分离物的分析、16SDNA 同源性的分析中得到广泛应用[6]。
温度梯度电泳(TGGE)是利用不同构象的分子具有不同的变 性温度来进行分离, 最先应用于DNA /RNA 的分子构象分析和序列变异分析, 是一种新出现的检测点突变的电泳技术, 其最大特点上具有高分辨能力。单链构象多态性(SSCP)也是根据不同的结构对DNA在凝胶中迁移速率影响很大, 结果不同序列的DNA 片段在凝胶上得以高分辨率的分离。基因芯片可分为cDNA 芯片、寡核苷酸芯片及基因组芯片。在一定条件下, 载体上的核酸分子可以与来自样品的序列互补的核酸片段杂交。如果把样品中的核酸片段进行标记, 在专用的芯片阅读仪上就可以检测到杂交信号[7]。
分子生物学技术在环境微生物研究中的应用中rRNA 技术提供了一种摆脱传统的纯种培养方法而鉴定环境微生的途径,并已被广泛应用于微生物的各个领域。虽然当前,标准rRNA 技术的灵敏度还难以检测到低丰度的(低于1/ 1 000)在群落中仅占很小比例的微生物种类, 从而使之在微生物生态以及环境学上的应用受到很大的限制。然而, rRNA 技术与其它的分子技术以及特别是与传统的纯种培养方法相结合, 具备分析微生物多样性的巨大潜力。随着这些新的分子方法的不断改进以及rRNA 数据库中序列信息的不断增加, 我们能探知更多的未知的微生物世界。
参考文献：
[1]杨永华，姚健.分子生物学方法在微生物多样性研究中的应用[J].生物多样性，2000 8(3):337-342.[2]李 红,周友兵,陈炳耀,胡锦矗.分子生物学技术在微生物多样性研究中的应用[J].河北大学学报(自然版),2003 12(23).[3]朱诗应，戚中田.１６ＳｒＤＮＡ扩增及测序在细菌鉴定与分类中的应用[J].微生物与感染,2013 8(2):104-109.[4，7] 高小朋, 张欠欠, 任桂梅.分子生物学技术在环境微生物研究中的应用[J].延安大学学报(自然科学版),2008 9(27)：27-45.[5] 路则宝，白现广。分子生物学技术在微生物检验中的应用研究进展[J].红河学院学报，2013 4（1）38-46.[6]雷正瑜.16RsDNA序列分析技术在微生物鉴定中的应用[J].湖北生态工程职业技术学院学报，2006 1（4）：35-45.
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