细胞骨架观察实验设计_实验四细胞骨架观察
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细胞骨架观察实验设计
I、实验内容
一、正常细胞
二、秋水仙素处理 三、VP16处理 四、低温处理 II、实验流程
一、细胞传代
二、细胞爬片
1~2d
三、细胞处理
6h
四、细胞固定、免染、观察
1d III、实验过程
一、细胞传代
1、实验材料
VEC2、实验器材
超净台、CO2培养箱、普通冰箱、倒置显微镜、离心机、离心管、微量加液器、吸管、细胞培养瓶（皿）、镊子、酒精灯、消毒酒精、废液缸
3、试剂
胰酶、PBS、培养液（牛血清、双抗）
二、细胞爬片
已处理盖片
三、细胞处理
细胞爬片、秋水仙素、VP16、普通冰箱
四、细胞固定、免染、观察
1、实验材料
已处理的爬片
2、实验器材
离心机、离心管、玻璃培养皿、载玻片、滤纸、封口膜、温箱、荧光显微镜、微量加液器、镊子
3、试剂
PBS、BSA封闭液、一抗、二抗、蒸馏水、DAPI4、步骤
固定
爬片置于玻璃培养皿中，PBS（500uL）洗3次，每次2min 吸弃PBS，加-20℃预冷甲醇，固定5min 吸弃甲醇，PBS洗3次，每次2min 免染
吸弃PBS，加100uL 2﹪BSA封闭液，盖上培养皿盖，室温固定15min 滤纸吸去片子上封闭液，加30uL（1:500）稀释一抗，盖上封口膜（勿大于盖片），37℃孵育30min ,边上滴一滴PBS PBS洗3次，每次5min 在边缘吸弃PBS（滤纸），滴加30uL（1:200）稀释二抗，避光，盖封口膜，37℃,30min 揭去封口膜，PBS洗3次，每次5min 吸弃PBS，蒸馏水清涮，迅速，片子正面朝上，晾干
干净载玻片上，滴加3uLDAPI，将爬片镊子夹上，反盖于防淬灭剂上 荧光镜观察
IV、注意事项
1、区分盖片正反面
2、保持样品湿润
3、一抗二抗孵育后，封口膜轻轻冲起
4、二抗孵育后，避光操作，以免荧光淬灭
5、标本染色后立即观察，不看时4℃保存
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