生化实验_生化实验总
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1．火
（1）酒精及其它可溶于水的液体着火时，可用水灭火
（2）汽油、乙醚、甲苯等有机溶剂着火时，应用石棉布或砂土扑灭，绝对不能用水，否则反而会扩大燃烧面积。
（3）电起火，不能用水和二氧化碳灭火器，应切断电源或用四氯化碳灭火器。2．烧伤
（1）强碱烧伤：先用大量水冲洗，再用5%的硼酸溶液和2%的乙酸溶液冲洗。（2）强酸烧伤：先用大量水冲洗，再用5%的碳酸氢钠或5%的氢氧化铵冲洗。
氨基酸的分离鉴定纸层析法
纸层析法是用滤纸作为惰性支持物的分配层析法。层析溶剂由有机溶剂和水组成。物质被分离后在纸层析图谱上的位置是用Rf值（比移）来表示的：
在一定的条件下某种物质的Rf值是常数。Rf值的大小与物质的结构、性质、溶剂系统；层析滤纸的质量和层析温度等因素有关。本实验利用纸层析法分离氨基酸。
在操作过程中，手不要摸滤纸。点样直径不超过3mm。
点样的一端朝下, 扩展剂的液面需低于点样线1cm。
即时取出滤纸, 以免出现氨基酸层析跑到滤纸的外面不能检测。
蛋白质及氨基酸的呈色反应 双缩脲反应
紫红色
肽键 可用于蛋白质的定性或定量测定 一切蛋白质或二肽以上的多肽都有双缩脲反应，但有双缩脲反应的物质不一定都是蛋白质或多肽。茚三酮反应
除脯氨酸、羟脯氨酸和茚三酮反应产生黄色物质外，所有α—氨基酸及一切蛋白质都能和茚三酮反应生成蓝紫色物质。此反应的适宜pH为5~7，同一浓度的蛋白质或氨基酸在不同pH条件下的颜色深浅不同，酸度过大时甚至不显色。
与茚三酮呈阳性反应的不一定就是蛋白质或氨基酸。在定性、定量测定中，应严防干扰物存在。该反应十分灵敏，1∶1 500 000浓度的氨基酸水溶液即能给出反应，是一种常用的氨基酸定量测定方法。茚三酮反应分为两步，第一步是氨基酸被氧化形成CO2、NH3和醛，水合茚三酮被还原成还原型茚三酮；第二步是所形成的还原型茚三酮同另一个水合茚三酮分子和氨缩合生成有色物质。黄色反应
含有苯环结构的氨基酸，如酪氨酸和色氨酸，遇硝酸后，可被硝化成黄色物质，该化合物在碱性溶液中进一步形成橙黄色的硝醌酸钠。苯丙氨酸不易硝化，需加入少量浓硫酸才有黄色反应。
坂口反应
与精氨酸反应呈红色，精氨酸是唯一呈此反应的氨基酸，反应极为灵敏 醋酸铅反应
蛋白质分子中常含有半胱氨酸和胱氨酸，含硫蛋白质在强碱条件下，可分解形成硫化钠。硫化钠和醋酸铅反应生成黑色的硫化铅沉淀。若加入浓盐酸，就生成有臭味的硫化氢气体。
蛋白质分子中常含有半胱氨酸和胱氨酸，含硫蛋白质在强碱条件下，可分解形成硫化钠。硫化钠和醋酸铅反应生成黑色的硫化铅沉淀。若加入浓盐酸，就生成有臭味的硫化氢气体。
蛋白质的等电点测定和沉淀反应
当溶液的pH达到一定数值时，蛋白质颗粒上正负电荷的数目相等，在电场中，蛋白质既不向阴极移动，也不向阳极移动，此时溶液pH值称为此种蛋白质的等电点。
用醋酸与醋酸钠（醋酸钠混合在酪蛋白溶液中）配制成各种不同pH值的缓冲液。向缓冲液溶液中加入酪蛋白后，沉淀出现最多的缓冲液的pH值即为酪蛋白的等电点 蛋白质的沉淀反应
在水溶液中的蛋白质分子由于表面生成水化层和双电层而成为稳定的亲水胶体颗粒，在一定的理化因素影响下，蛋白质颗粒可因失去电荷和脱水而沉淀。蛋白质的沉淀反应可分为两类。
（1）可逆的沉淀的反应
此时蛋白质分子的结构尚未发生显著变化，除去引起沉淀的因素后，蛋白质的沉淀仍能溶解于原来的溶剂中，并保持其天然性质而不变性。如大多数蛋白质的盐析作用或在低温下用乙醇（或丙酮）短时间作用于蛋白质。提纯蛋白质时，常利用此类反应。
（2）不可逆沉淀反应
此时蛋白质分子内部结构发生重大改变，蛋白质常变性而沉淀，不再溶于原来溶剂中。加热引起的蛋白质沉淀与凝固，蛋白质与重金属离子或某些有机酸的反应都属于此类。
蛋白质变性后，有时由于维持溶液稳定的条件仍然存在（如电荷），并不析出。因此变性蛋白质并不一定都表现为沉淀，而沉淀的蛋白质也未必都已变性。
考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度
考马斯亮蓝G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰(max)位置由465 nm变为595 nm，溶液颜色也由棕黑色变为蓝色。通过测定595 nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。吸光度与蛋白质含量成正比。灵敏度高，测定快速简便，干扰物质少。
微量凯氏定氮法
有机物与浓硫酸共热，有机氮转变为无机氮（氨），氨与硫酸作用生成硫酸氨，后者与强碱作用释放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此过量酸液被中和的程度，即可计算出样品的含氮量。
中和程度用滴定法来判断，分回滴法和直接法两种。
（1）回滴法：用过量的标准酸吸收氨，其剩余的酸可用标准NaOH滴定，由盐酸量减去滴定所耗NaOH的量即为被吸收的氨之量。此法采用甲基红做指示剂。
（2）直接法：用硼酸作为氨的吸收溶液，结果使溶液中[H+]降低，混合指示剂（PH4.3－5.4），黑紫色变为绿色。再用标准酸来滴定，使硼酸恢复到原来的氢离子浓度为止，指示剂出来淡紫色为终点，此时所耗的盐酸量即为氨的量。
样液：1g卵清蛋白溶于0.9%NaCl液，并稀释至100ml。如有不溶物，离心取上清液备用。
醋酸纤维薄膜电泳法分离血清蛋白质
本实验是以醋酸纤维素薄膜作为支持体的区带电泳。
方法是将少量新鲜血清用点样器点在浸有缓冲液的乙酸纤维素薄膜上，薄膜两端经过滤纸与电泳槽中缓冲液相连，所用缓冲液pH值为8.6，血清蛋白质在此缓冲液中均带负电荷，在电场中向正极泳动。
由于血清中不同蛋白质带有的电荷数量及分子量不同而泳动速度不同。带电荷多及分子量小者泳动速度快；带电荷少及分子量大者泳动速度慢，从而彼此分离。
电泳后，将薄膜取出，经染色和漂洗，薄膜上显示出五条蓝色区带，每条带代表一种蛋白质，按泳动快慢顺序，一般经漂洗后，薄膜上可呈现清晰的5条区带，由正极端起，依次为清蛋白、α1-球蛋白、α2-球蛋白、β-球蛋白和γ-球蛋白。
经洗脱比色观察不同蛋白质的区带。
1、醋酸纤维素薄膜一定要充分浸透后才能点样。点样后电泳槽一定要密闭。电流不宜过大，以防止薄膜干燥，电泳图谱出现条痕。
2、缓冲溶液离子强度不应小于0.05或大于0.07。因为过小可使区带拖尾，过大则使区带过于紧密。
3、电泳槽中缓冲液要保持清洁(数天过滤)两极溶液要交替使用；最好将连接正、负极的线路调换使用。
4、通电过程中，不准取出或放入薄膜。通电完毕后，应先断开电源后再取薄膜，以免触电。
酶的特性
温度对酶活力的影响
大多数动物酶的最适温度为37－40℃，植物酶的最适温度为50－60℃。高温失活，低温能降低或抑制酶的活性，但不能使酶失活。pH对酶活性的影响
唾液淀粉酶的最适pH约为6.8。唾液淀粉酶的活化和抑制
酶的活性受活化剂或抑制剂的影响。氯离子为唾液淀粉酶的活化剂，铜离子为其抑制剂。
血糖的定量测定
动物血液中的糖主要是葡萄糖，其含量较恒定。用硫酸锌和氢氧化钠除去被检测血中的蛋白质制成无蛋白血滤液。当将血滤液与标准铁氰化钾溶液共热时,一部分铁氰化钾还原成亚铁氰化钾，并与锌离子生成不溶性化合物。
向混合物中加入碘化物后，用硫代硫酸钠溶液滴定所释放的碘。即可知剩余的铁氰化钾量。血糖越多，剩余的铁氰化钾越少，所消耗的硫代硫酸钠也越少。硫代硫酸钠溶液用量与血糖的关系可以由经验确定下来的数字表查出。对照组要多一些，且要先查表再相减
脂肪酸的β－氧化
样品中丙酮的含量=(V1-V2)x C Na2S2O3 x 1/6 V1—滴定对照所消耗的Na2S2O3 的体积 V2—滴定样品所消耗的Na2S2O3 的体积 C—Na2S2O3 的浓度
维生素C的定量测定
2，6-二氯酚靛酚滴定法
用蓝色的碱性染料标准溶液,对含维生素 C的酸性浸出液进行氧化还原滴定,染料被还原为无色,当到达滴定终点时,多余的染料在酸性介质中则表现为浅红色,如无其他干扰物质存在，样品提取液所还原的标准染料量与样品中所含的还原性抗坏血酸量成正比。
过氧化物酶的作用 过氧化物酶能催化过氧化氢释出新生氧以氧化某些酚类和胺类物质，例如氧化溶于水中的焦性没食子酸生成不溶于水的焦性没食子橙（橙红色）；氧化愈创木脂中的愈创木酸成为蓝色的愈创木酸的臭氧化物。
目前测定蛋白质含量的方法有很多种，下面列出根据蛋白质不同性质建立的一些蛋白质测定方法：
物理性质：紫外分光光度法。
化学性质：凯氏定氮法、双缩脲法、Lowry法等。染色性质：考马斯亮蓝染色法、银染法。其他性质：荧光法。
一、凯氏定氮法： 根据蛋白质的含氮量来测定蛋白质的含量
公式:每g样品中含氮克数 × 6.25 ×100
二、比色法：利用蛋白质与不同试剂的呈色反应，测定蛋白质的含量，如双缩尿法和酚试剂法（lowry’s method）。
三、紫外分光光度法：利用蛋白质对280nm紫外光有最大的吸光度而采用
