小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养_小鼠胚胎成纤维细胞

小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养由刀豆文库小编整理，希望给你工作、学习、生活带来方便，猜你可能喜欢“小鼠胚胎成纤维细胞”。

小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养

一、实验材料 1．主要仪器设备

倒置显微镜、培养箱、离心机、25ml玻璃培养瓶、吸管；10ml尖底离心管、Ф80mm玻璃培养皿、青霉素小瓶、小鼠用解剖器械（包括眼科剪和眼科镊）2．试剂

RPMI 1640培养液、平衡缓冲生理盐水(PBS, pH7.2-7.4)、0.25%胰蛋白酶 3．实验动物

孕14～15天(E14～16)昆白母鼠，领自福建医科大学实验动物中心。

二、实验步骤

1.获取小鼠胚胎

(1)取孕14～15天的母鼠，断颈处死，置于蜡盘上

(2)75％酒精消毒后，用剪刀和镊子剪开下腹皮肤，用两把弯头止血钳夹住切口处的皮肤向头尾两侧牵拉即剥皮，用眼科弯镊和眼科弯剪打开腹腔，暴露出子宫。(3)用眼科弯镊夹住一侧子宫，分离子宫系膜，眼科弯剪剪断子宫角和子宫颈，将整个子宫分离下来（注意勿使子宫滑落到腹腔外，避免污染）。将子宫置于无菌滤纸上去除血迹。

(4)在超净台内将子宫移入预先盛有PBS的培养皿中，洗涤数次。

(5)将子宫移入另一盛有PBS的培养皿中，用眼科弯剪沿子宫系膜打开子宫，取出带有胎膜的胎鼠，并用两把眼科镊子剔除胎膜，取出胎鼠（一般有12只）。

(6)将胎鼠移入另一盛有PBS的培养皿中，用眼科剪和眼科镊去除胎鼠的头、四肢和内脏，得鼠胚躯干。

(7)将鼠胚躯干移至另一盛有PBS的培养皿中，用PBS洗涤两次至无肉眼可见的血色。

2.小鼠胚胎成纤维细胞的原代培养（组织块半消化法）

(1)将干净的鼠胚躯干移至青霉素小瓶内（每6个鼠胚躯干装1瓶），用眼科直剪剪成约1 mm3以下的碎块。

(2)用5ml的刻度吸管每瓶加入约3ml的PBS，混匀后连同鼠胚碎块一起移至一尖底离心管中。

(3)室温下静置5min，用刻度吸管吸去上清液，留下鼠胚组织碎块。

(4)向装有鼠胚碎块的离心管内加入1ml 0.25%胰蛋白酶消化液，轻轻吹吸30秒（可见组织块变得较为粘稠）。

(5)加入1 ml 1640培养液终止消化，室温下静置5min，吸去上清液，留下鼠胚组织碎块沉淀。

(6)每个离心管内加入5ml 1640培养液悬浮鼠胚组织块，并接种到25ml的螺口的培养瓶中（接种时应用滴管将组织块混匀）。(7)做好标记（如培养日期，细胞名称，编号），将装有鼠胚组织碎块的培养瓶放入37℃，5％CO2，100％相对湿度的培养箱中培养。

(8)培养的头两天不要晃动培养瓶，第三天可以观察，可见组织碎块附着于培养瓶底，周围细胞呈放射状生长，此时有多种细胞类型，有的是呈梭形的成纤维细胞，有的是呈圆形的上皮细胞。