艾滋病检测质量管理工作指南_艾滋病检测工作方案

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艾滋病检测质量管理工作指南

前言

为了认真贯彻1997年9月中华人民共和国卫生部颁布的《全国艾滋病检测工作规范》（下称“规范”），不断提高艾滋病检测工作质量，最大限度地防止误检和漏检，保证我国HIV抗体初筛和确认实验室检测结果的正确性和准确性，避免实验室交叉感染，更好地发挥HIV检测在艾滋病防治工作中的作用，需要建立一个全面的质量管理体系。为了帮助各级艾滋病实验室做好室内质控工作，并帮助省级艾滋病确认中心开展本地区内HIV抗体检测的质量评价工作，特制定《艾滋病检测质量管理工作指南》（下称“工作指南”），主要内容包括HIV实验室检测的质量保证（Quality Aurance，QA），质量控制（Quality Control，QC）和质量评价（External Quality Aement，EQA）。质量保证、质量控制和质量评价是HIV测定的重要部分。在全面质量管理体系中，实验室内质量控制是一个重要的环节，是保证高质量操作必不可少的措施。HIV检测的室间质量评价又是使全面质量保证体系标准化、法制化的一个途径。

因此建立运行良好的质量管理体系是保证全国高质量艾滋病检测实验室工作的重要因素。

本工作指南是在质量管理方面履行《规范》的具体实施办法，适用于我国境内按《规范》程序批准的所有各级艾滋病检测实验室。各级卫生行政部门负责辖区内艾滋病检测实验室实施本工作指南的监督工作。

一质量保证（QA）

（一）定义

质量保证是指从接收检验标本起，到实验室发出报告止，为确保实验室最终报告结果的正确性所进行的全过程，包括采取各种行政和技术上的措施和方法。

质量保证是确保实验结果质量的基本条件，其实施程度直接影响试验结果和最后报告的每个参数。质量保证取决于良好的质量控制程序，并经良好的质量评价程序加艾滋铺检测质量管理工作指南以鉴定。因此，要求所有的实验室工作人员有责任时刻注意解决影响实验结果的每个环节上可能出现的问题。

（二）实验室质量保证

1.行政支持

HIV初筛和确认实验室的质量保证是整个艾滋病检测工作的组成部分。要实施全面质量保证，除了各级卫生行政部门加强监督，责成专门机构负责日常管理工作外，应要求实验室所在单位加强自身管理，保证实验室主要负责人和检测人员相对稳定，并给予人力和物力的支持。

2.实验室规范化

HIV初筛实验室和确认实验室的设置及其建筑、设施、设备必须符合《规范》要求。

3.人员培训及其评价

实验室人员必须接受过HIV初筛和确认实验室的业务培训并获得合格证书才能上岗操作。各级实验人员应该通过定期和不定期的业务学习和在岗培训，从不同渠道不断地提高自己的检验水平。在开展质控前，每个实验室检验人员都应对质控的重要性、基础知识和一般方法有较充分的了解，并在质控的实际过程中不断进行培训提高。实验室主管必须具有较高的质量意识，领导整个实验室工作人员参加质量管理工作，并对实验室检验人员定期作出评价，包括工作的准确性、工作效率、执行安全条例和规章制度、职业道德、出勤率以及上岗资格等。

4.标本的采集、运送和处理

标本的采集、运送和处理必需符合《规范》要求。

5.检测结果的判定及其程序

参见《规范》第3-6页。

6.检验方法、仪器和试剂盒的选择

实验室检验应使用最可靠的测定方法，检测仪器须经严格选择和科学的评价。在我国防疫系统、临床检测以及采供血系统中使用的HIV检测试剂（国产和进口）均必须是经过国家药品监督管理局批准和中国药品生物制品检定所批批检合格的诊断试剂盒，各HIV检测实验室在使用试剂时，应优先选择经过临床评估质量优良的试剂盒。

7.设备维修与校准

实验室中的设备必须定期进行维修与校准，并制定设备维修与校准的制度。

（1）ELISA洗板机与酶标读数仪是检测HIV的最常用和最重要的仪器，应该设立预防性的维护制度，以保证仪器的正常工作。推荐方法如下：

每天：每次操作要按要求设立对照。核对酶标仪滤光片波长，检查洗板机管道是否通畅，是否有漏液现象。

每周：清洗仪器表面，保护光学零件，不沾灰尘。

每月：洗涤时检查各孔是否与相应的冲洗头对位良好，负压是否符合规定要求。这是保证各孔洗涤均衡一致的前提。

每年：检查、清洗滤光片，如果滤光片出现破裂或霉点则要更换，根据仪器内具有的校准程序或使用校准板，对滤光片的所用波长吸光度的精密度进行校验，测定20次，计算精密度。精密度应该控制在厂家说明书中所规定的范围（建议请厂方代表校验）。校验结果要有记录，保留测定原始结果。根据实际使用情况更换主要设备（如洗板机、全自动免疫分析系统）内的所有液体装置和管子（要求厂方代表维修）。

（2）移液器（包括单头和多头移液器）是实验室中重要的基本器具，一年至少应该标定或校准二次，若发现移液器有异常情况，应该立即进行标定。移液器标定方法包括吸取有色榕液进行光谱分析、吸取蒸馏水称量校准、吸取放射性同位素计数校准，以及使用配套校准盒等等。特别要注意使用多头移液器时，必须保证每一个加样头都能够连续和准确的加样。移液器的精密度可根据生产移液器厂家说明书中所规定的范围进行校准。推荐在检测过程中，每个加样工序使用专用的移液器。

范例：用蒸馏水称量标定移液器方法（参考芬兰Labsystems移液器标定方案）在一室温为22℃的小型工作室（无风）中，在万分之一级别天平上放置一个小三角烧瓶，用待标定的移液器吸取蒸馏水（隔夜存放）加入小三角烧瓶内底部，每次称重后计量，去皮重后再加蒸馏水，连续加蒸馏水10次。加蒸馏水的量根据待标定的移液器不同规格而不同，见下表，移液器标定合格后，在移液器上贴上合格标签，标明日期。在移液器标定记录中填写移液器规格、编码、10次标定称量、标定日期和标定人签名。移液器10次标定称量在所要求的重量范围内为合格移液器：不合格移液器要根据移液器生产厂家所推荐的方法进行校准。

芬兰Labsystems移液器标定方案 移液器规格 0.540μl 401000μl 110 ml 标定使用蒸馏水量 2μl 10μl 70μl 300μl 2000μl 3500μl 要求重量范围 1.7510.2 mg 69.4302.0 mg 1990.03515.0 mg

（3）定期检查室内普通冰箱和孵育箱的温度并作好记录，-20℃和-70℃冰箱必须每天检查和记录。

（4）定期检查其他相关的仪器设备。8.文件和文件管理

（1）建立标准操作程序文件（SOP）

SOP是书面质量体系中的一个很重要的部分。SOP是指导完成筛查（检测）工作的一整套书面操作指南，因而任何实验室应就本实验室所有重要工作制定相应的SOP。每一种检测项目都应该备有一份SOP，其中包含有详细的操作程序例如实验室实验条件（温度等）、仪器的使用和维护、试剂、质控品、校准品的使用等SOP（设备和试剂盒说明书作为附录），以避免或减少因不同的操作者所引起的误差。SOP由各岗位工作人员起萃，实验室负责人审定。实验人员在操作时应该严格按照SOP进行，实验室主管应该督查实验人员执行SOP。必要时，SOP中的内容如说明书或相关内容应该在实验室主管的领导下进行修订，每年至少修订一次。修订后的SOP按审批程序批准后使用。

SOP正规编写通常包括以下内容：

1）清楚、简洁的标题和统一的SOP编号 2）SOP编写和修改日期

3）编写和修订SOP的人员姓名 4）方法目的和原理 5）相应的职业规范 6）检测设备和试剂

7）参考其他包含相关步骤的SOP 8）健康和安全操作指南（参考传染性标本处理和废物安全处理SOP）9）每一操作步骤和质控步骤用编号描述

10）结果的讨论和报告以及出现问题时所采取的措施

11）附录，包括相关的附加文件如标准表格、设备和试剂盒说明书等。例1一般日常检测（60人次），应该考虑使用以下相应的SOP（1）标本的接收和处理（2）进行检测（3）洗板器的使用（4）酶标仪的使用（5）结果的报告

（6）阳性血样的追踪和处理（7）实验室的清理和消毒

例2对特殊检测（>60人次），实验室SOP应该考虑包括以下附加内容（1）待检标本的类型（2）所有检测试剂的配制（3）必要的核对和记录步骤（4）检测前标本的处理

（5）试剂盒对照和外部对照标本的应用（6）使用的检测设备（7）应用的方法

（8）实验记录中检测数据的记录（9）读取结果的方法

（10）初检阳性标本的复测（11）最终结果的计算（12）结果的使用（13）下一检测工作的准备（14）检测结束后的清洁处理（2）建立实验原始记录表

每次实验前，应该根据本实验的要求，设计一份操作的原始记录表，在表中分别标明空白对照、阳性对照、阴性对照以及各待检样品的确切位置，以便于指导实验人员加样。要注明试剂盒来源、测定方法（包括反应时间和温度等）、批号、失效期；操作人员和复核人员姓名、操作日期。（3）建立HIV抗体检测程序 见《规范》第3-6页。（4）填写检测结果表

HIV抗体初筛阳性送检化验单和HIV抗体检测确认报告单见《规范》第16和17页。

（5）建立标本的登记记录

实验室收到标本后，有关参数应该及时登记在标本的登记记录中，包括受检者的姓名或代号、试管编号、性别、年龄、职业、送检单位、人群类别、检验结果（包括初筛、复检、确证）、送检日期、报告日期、备注（必要时记录通信地址）。

（6）建立HIV阳性标本的保存记录

记录中填写阳性标本血清/血浆的储存量、标本储存温度、标本储存起始时间以及标本保管人姓名。所有经确认的阳性标本，包括实验室留存的标本，应送省级HIV抗体确认中心或省级卫生行政部门指定的单位保存，不得擅自处理。（7）建立实验室安全措施 参见《规范》附件一，第9页。（8）文件存档

原始记录包括实验原始记录表、打印数据、膜反应条带或其照片、检测记录表、标本登记记录、标本保存记录以及仪器设备维修和校准记录等重要记录都应该妥善存档保存15年以上。推荐同时使用计算机保存各种文件和记录。内含病人姓名的所有工作记录一定要保密，参见《规范》第8页.二.质量控制（QC）

（一）定义

质量控制是指为确保实验工作正常进行而在每一次实验过程中必须采取的各种措施。

质量控制也是实施实验室质量保证的一部分，它表明每一步操作产生可信的结果。质量控制具体内容是指将控制品（内部对照或外部对照）和检测标本一起实验操作，从控制值了解分析过程的质量情况。为便于观测和概括，又使用了一些统计学方法进行归纳和分析。质量控制的最终结果可以了解本次实验是否有效，所有试验条件是否正常，以及所有试验结果是否可靠。检测HIV抗体后能提供准确的检验报告，是每一个从事HIV抗体检验的实验室的最高宗旨。而为了达到这一目的，建立一个良好的质量控制程序是十分重要的。必须强调的是，实验室室内质量控制是室间质量评价（外部质量评价）的基础。

（二）实验室质量控制的基本要求

1.必须使用经卫生部批准或注册，经过中国药品生物制品检定所批批检定合格的国产或进口HIV抗体初筛和确认检测试剂。初筛用的HIV检测试剂必须是HIV一1/2混合型。在选用试剂时应优先选择经过临床评估质量优良的试剂盒。2.必须使用在有效期内且保存条件符合要求的诊断试剂。

3.必须按照SOP中规定的要求进行操作，包括进行检测的实验条件如阳性对照和阴性对照的设置、试剂、标本加样量、孵育时间、反应温度、洗涤程序和次数等。

4.在实验前必须检查所有待检标本的质量，如有脂血、溶血或污染的标本原则上不能使用，必须重新采集标本。若无法重新采集标本，必须在室主管批准下使用，在检测结果中应该注明该份标本的情况。5.冰冻的标本待全部融化后必须充分摇匀。

（三）质量控制

一般使用内部对照质控血清和外部对照质控血清来进行质量控制。在所有实验中必须包含有内部对照质控血清和外部对照质控血清，实验中的内部对照质控血清和外部对照质控血清的平均光密度值以及临界值可以监测批间操作的重复性。我们目前在HIV抗体检测的质量控制实验中所使用的外部对照质控血清为设置在临界值附近的弱阳性对照，如果弱阳性对照在临界值（Cut-off）附近出现波动，提示本次实验中有可能对光密度值（OD值或A值，下称OD值）在Cut-off值附近的未知标本作出错误的阳性或者阴性的判断。若弱阳性对照向负值偏移，可能导致出现一些假阴性，反之则可能出现假阳性。这是在HIV抗体检测中必须重视的现象。1.内部对照质控血清

内部对照质控血清是指每个试剂盒内厂方提供的一套阴性和阳性对照血清。内部对照对每一次实验的质量控制措施来说是必要的，是质量控制的基础。每一次检测必须使用内部对照，而且内部对照只能在该批号生产的试剂盒中使用。2.外部对照质控血清

外部对照质控血清是各级实验室为了监控每次检测的重复性和稳定性以及检验试剂盒批间差异而设置的一套阴性和阳性对照血清。设立外部对照还可以提示标本处于临界值状态时的检验操作情况。（1）外部对照质控血清的组成理想的外部对照应该包括阳性对照、弱阳性对照、临界值对照和阴性对照。但是目前各实验室应该在每次实验时设置一个单一浓度水平的质控品即弱阳性对照。这个弱阳性对照的值以设定在各试剂盒Cut-off值的2-3倍为宜。（2）外部对照质控血清的来源和选择 1）通过向有关机构购买获得

2）通过实验室制备获得（比较经济的方法）

①混合试剂盒内部对照血清，等量分装。②混合HIV抗体阳性或阴性人血清，3000转/分钟离心15分钟，用0.2μm生物滤膜过滤除菌后再进行56℃30分钟加热灭活处理。弱阳性对照可以通过使用HIV抗体阴性的正常人血清梯度稀释HIV抗体强阳性血清并经标定后得到。弱阳性对照的OD值以2-3倍于Cut-off为宜。（3）外部对照质控血清的保存

1）外部对照血清或血浆的一次制备量应该足够为本实验室使用一年 2）外部对照血清应该均

一、无菌

3）外部对照血清标定后应该等量分装，每个对照应该有足够的量供一周内实验用

4）外部对照应该分类作好标记，使用不同颜色的标签

5）外部对照血清应该存放在一70℃，如无条件则存放在非自动除霜的一20℃冰箱

6）外部对照血清一旦融解以后应该存放在2一8℃，一周后必须弃去，不能重新冻存。

（4）外部对照质控血清的使用

原则上每一次实验必须使用外部对照质控血清，建立质控图，以便监控实验操作的一次性和结果的准确性。同时，可以了解各批试剂盒之间的误差（批间差异）。

3.质量控制的统计学处理

（1）试剂盒内部对照质控血清范围和统计学处理按照各试剂盒说明书进行。（2）外部对照质控血清的标定和统计学处理主要是根据确定可信限范围来确定外部对照值的允许范围，l）建立质控图参数

对HIV抗体检测（ELISA）外部对照质控血清的评价采用多次测定的OD值的均值上下各两个标准差的范围，即外部对照OD值的95%可信限为x±2s。各个外部对照的标定即确定外部对照的均值和可信限可用几个统计学参数如均值（x）、标准差(s)以及变异系数（cv）来确定可信限。

①算术平均值（x）代表一组OD值数的平均值，为了统计学上有显著性意义，应该采用至少20次（天）所测得的外部对照质控血清OD值结果计算出平均值。②标准差（s）是描述样本与均数之间离散程度的一个指标，是与对照值的均值有关的预期范围。一组OD值标准差以s代表。

③变异系数（cv），是反映各次OD值相对于均值的离散程度的一个指标，可以用于衡量被检标本检测的重复性或精密度。

范例：参考郑怀竞主编《免疫学检验室间质评与室内质控》，1997年出版。次数 质控血清 OD Cut-off值

OD S/CO值 0.180 0.105 1.71 2 0.190 0.105 1.81 3 0.200 0.105 1.90 4 0.288 0.105 1.81 5 0.137 0.105 1.09 6 0.221 0.105 2.10 7 0.150 0.105 1.43 8 0.170 0.105 1.62 9 0.180 0.105 2.14 10 0.150 0.105 1.43 11 0.200 0.105 1.90 12 0.142 0.105 1.35 13 0.210 0.105 2.00 14 0.221 0.105 1.52 15 0.180 0.105 1.71 16 0.190 0.105 1.81 17 0.160 0.105 1.52 18 0.221 0.105 2.10 19 0.210 0.105 2.00 20 0.150 0.105 1.43

通过上表，计算S/CO值的均值（），标准差（s）和变异系数（cv）= 1.72 s = 0.29 cv = 16.9% 根据以上数据绘制室内质控框架图

利用质控图可以对每次检验的结果进行监测，举例见下表，并将表中每次检验S/CO值点入质控图中

次数 日期 质控血清OD Cut-off值 S/Co值 7.4 0.160 0.105 1.52 22 7.7 0.190 0.105 1.81 23 7.8 0.200 0.105 1.90 24 7.11 0.228 0.105 1.81 25 7.12 0.139 0.105 1.10 26 7.15 0.221 0.105 2.10 27 7.16 0.150 0.105 1.43 28 7.18 0.170 0.105 1.62 29 7.19 0.225 0.105 2.14 ④质控图的判定和分析

a.如果检验进入质控状态时，质控对照值超出土2s，则本次实验结果不能被接受（失控）。可能是系统误差或外部对照滴度下降造成。

b.位移：如果几个连续质控对照值（3-5次）都落在均值（中心线）的一边则称之为位移，通常表示存在大的变化（失控）。引起位移的原因有使用新批号的试剂盒、使用新试剂、实验员的更换、孵育温度的改变、仪器（移液器）故障等。

c.趋势：当几个连续质控对照值（5-7个）几乎按一个方向分布时称之为趋势（失控），通常由参数的缓慢改变引起，如试剂失效和移液器逐渐不准确等。发生漂移和趋势的最常见的原因是试剂（如酶标记物）或对照的失效。⑤质量控制图建立和分析的注意要点：

a.可以先进行最佳条件下的变异测定，即在最佳条件下（人、仪器、试剂、实验室等因素）对同一批质控血清连续进行测定20次以上，获得一组数据，求： 和s值。然后求出常规条件下的x和s。如果常规条件下的x和s值与最佳条件下的 和s值比较接近，则可以接受。若不作最佳条件下的测定，可以用本室以往处于控制状态下的数值替代。

b.采用S/CO比值制图要比单用OD或A值制图的方法给出更为精确的评估，因为它将每次/每天OD值的浮动考虑在内。从S/CO质控图中可以直观地发现外部对照值的漂移和趋势。

c.由专人负责建立质控图，每月（月末）定期召开质量控制会，讨论本月检测的质量控制情况。检验人员在每次检验之前，了解一下质控图的结果，做到心中有数。

d.建议长期和稳定地使用一种质量好的试剂盒（各实验室本身可以进行试剂盒质量的比较）。由于不同厂家生产的ELISA试剂盒所使用的HIV抗原的构成（env,gag或pol区）以及使用比例不同，因此对同一标本的反应会有差异，表现在A值相差较大，对外部对照质控血清结果的分析造成困难。

e.如果改用新批号试剂盒，必须重新制作室内质控框架圈，并建议对新旧两批试剂盒进行平行性试验，平行性试验包括外部对照质控血清和前一批试剂盒中的内部对照质控血清。这种平行性试验有利于质量控制和分析。

f.使用新批号或使用不同厂家的试剂盒都必须在质控图上注明使用日期。原则上，更换不同厂家生产的试剂盒后，结果偏离程度较大时，必须重新计算均值和标准差并建立新的质控图。

g.发现全部对照值剧烈位移，立即报告室主管，分析原因，若是试剂盒质量问题，立刻通知厂家。

h.外部和内部阴性对照质控血清出现高值倾向，应该注意试剂、技术或设备出现问题（如洗板机等）。

i.实验室配制新批次的外部对照质控血清或变动外部对照质控血清的值时，必须重新计算均值和标准差，建立新的质控图。

j.操作者在测定质控血清时，发现质控血清数据违背了控制规则，应填写失控报告单，上交室负责人，由室负责人决定是否要发出检验报告。3）cv分析

变异系数（cv）在20%），可以提示加样量不一致。校准加样器以及每次更换吸头加样可以减少cv值使对照值更趋一致。

（四）灰色带反应

通常把在Cut-off±10%的标本定为灰色带反应。对灰色反应区标本应进行复检，这将有助于发现早期感染者。三.室间质量评价（EQA）

（一）定义

质量评价是一种手段，用于判定实验室测定结果的质量。通常使用有关权威机构提供的一套质控品（质量控制参比血清）从外部来评价实验室的工作，即对数个实验室的检测结果进行统计分析和评价。这种评价方式常称为室间质量评价（EQA）。质量评价用于评价质量保证体系的效果，其目的在于帮助发现其质控与质保系统有无问题。各实验室可根据上一级提供的质评检验报告的结果，检查其质量控制状况。

（二）室间质量评价体系

1.国家艾滋病参比实验室和个别省级HIV抗体确认中心接受国际相关机构的质量评价。

2.国家艾滋病参比实验室对全国各省、自治区和直辖市的HIV确认中心实验室和其他HIV抗体确认实验室进行质量评价，并负责提供质量评价标本、标准以及有关文件。

3.省级HIV确认中心实验室对所在省份内各级HIV抗体初筛实验室进行质量评价。

（三）室间质量评价程序

1.国家艾滋病参比实验室负责建立和发放实验室间质量评价标本。并通知被评价实验室，质量评价活动中的质量评价的项目、质量评价标本的数目和数量、检测时间、报告要求、截止时间。

2.被评价实验室收到室间质量评价标本后，根据上一级质量评价部门的要求，按照日常检测条件和程序进行盲检。

3.被评价实验室必须按规定时间书面报告质量评价标本的盲检结果，书面报告中必须包括进行质量评价的详细方法和结果（包括原始记录的复印件）。报告书经操作人员和实验室主管签字方为有效。

4.各级质量评价部门收到被评价为实验室提交的报告书后应该及时进行分折与统计处理，并作出本次质量评价结论，写出质量评价报告。

5.各级质量评价部门应该按时或尽早将质量评价报告寄给被评价实验室。有问题的实验室应该认真寻找失控原因，纠正偏差。在上一级质评部门的许可下，被评价实验室可以再进行1一2次的复检，复检结果按时报送上一级质评部门。6.对各级实验室的质量评价定为每年不少于一次。

7.若有必要，上一级评价部门可以建立巡回观察员进行巡回监察的制度，可以通过不定期、不通知的方法委派观察员直接送质量评价标本到被评价实验室，指定用常规方法当场做规定的一组质评标本。

（四）质量评价管理

1.实验室质量评价工作每年要进行总结，以提高质量评价的工作质量。2.表彰质量评价工作做得好的实验室，推广和宣传质量管理好的经验。3.对多次质量评价不合格的实验室，由主管机构（卫生部疾病控制司和省级卫生行政部门）分别给予限期改进、停止工作整改和撤销实验室资格的处理。

（五）质量评价参比标本

实验室外部质量评价参比标本，由国家艾滋病参比实验室制备和发放。1.质量评价参比标本由经确认试剂确证的HIV抗体阳性、弱阳性和阴性三种血清/血浆所组成，2.质量评价参比标本必须经过严格标定和统计学处理（由20-30家确认实验室检测结果统计），标定值以及统计学数据必须保密。

3.质量评价参比标本血清/血浆应清亮、不溶血、无菌和无过多的脂质。4.质量评价参比标本经加热灭活并加防腐剂处理。

5.质量评价参比标本等量分装后分类（以不同颜色）在一20℃或一70℃冷冻储存，专人保管和记录使用情况。

6.各个质量评价参比标本试管贴上标签，注明名称、编号、保存条件、发放单位以及有效期。

7.质量评价参比标本分发时，一套质控物（阳性标本、弱阳性标本和阴性标本）有一个外包装，外包装上注明质量评价参比标本，低温或快件邮寄。

8.失效的剩余质量评价参比标本的处理，按传染性生物材料处理的办法执行。本工作指南在实施过程中不断积累经验，并根据国内外HIV检测技术的发展和国家对HIV检测质量管理工作的要求，将作定期修改和补充。