病理组织切片制作技术_病理组织切片制作

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病理组织切片制作技术

病理组织切片常用的制作方法有三种。即石蜡切片法，冰冻切片法和火棉胶切片法。以石蜡切片法为代表，切片的基本制作过程是：

组织取材→固定→冲洗→脱水→透明→浸蜡→组织包埋→组织切片→展片附贴→切片脱蜡→染色→脱水→染片透明→封固。

以上基本过程是互相联系的，任何一环节出现问题，都将使整个切片制作归于失败。因此应细致、耐心、认真负责，并事先做好计划安排。

一、取材

采取病料，要刀剪锐利，剪切时不可挤压，扯拉病料，以防人为损伤。切取的工具要清洁。采取病料越新鲜越好，一般不超过死后24小时。应选择病变部与可疑病变部切取，切取时要由表及里，有浅入深并包括周围正常组织一部分。特殊病料应根据器官的结构特点切取。管状，囊状和皮肤组织应注意垂直切取（横切）。带有薄膜的组织，要防止切时薄膜分离和脱落。

切取组织块大小，以1.5×1.5×0.3厘米为宜，最厚不宜超过0.5厘米。组织块病变一面应平整光滑，另一面可不平整，以便包埋时辨认。切取后，放入事先准备好的装有固定液的磨口玻璃广口瓶中，并做好标记。

二、固定

固定的目的是迅速将组织细胞杀死，使细胞中的蛋白质，糖，脂肪等凝固，从而保持与活组织相似的结构状态。材料取下后，应迅速固定。固定液数量应为病理组织块的5到20倍。由于一般把组织块浸入固定液后数小时，固定液渗入组织液的深度只达2到3厘米。因此，可以放置冰箱内固定，使组织内酶失去作用，细菌也能停止滋生。

最常用的固定液是10%的福尔马林溶液：使用时，用40%的甲醛饱和水溶液10毫升，加水90毫升配成。

三、冲洗

固定后的组织块，应将固定液洗去。一般均用流水（自来水）冲洗12到24小时左右。及时冲洗尚有停止固定的作用，防止固定过度，有利于制片染色。

冲洗时如不方便用流水冲洗，也可用较大容器盛装水浸洗，每隔相当时间换水一次。整个浸洗时间比流水冲洗应稍长一些。酒精固定的组织材料不需冲洗。

四、脱水

经过固定的组织，冲洗后要进行脱水。脱水的目的在于将组织内的水分用酒精或其他溶剂置换出来，为石蜡等其他包埋剂浸入组织创造条件。常用的脱水剂为酒精。由于酒精可以任何比例与水结合，对组织穿透力强，又能使组织硬化，因而不能将组织从水中直接移入浓度高的酒精中，应从低浓度逐渐到高浓度。脱水必须充分，否则给浸蜡造成困难。

除用酒精作脱水剂外，还可以用正丁醇（N—Butyla alcohol）。正丁醇微溶于水，能与各种浓度酒精混合，也能直接溶解石蜡。故组织经正丁醇脱水后，不须经二甲苯透明。用正丁醇作脱水剂，组织块收缩减低，也不会过硬，故比酒精优越。

五、透明

透明的目的是将组织内的酒精用矿物油或植物油置换出来，并溶解石蜡，帮助石蜡浸透组织。由于经过透明剂处理的组织块用肉眼观察呈透明状，故称这一过程为透明。常用的透明剂为二甲苯（Xylol），因其穿透力较强，因而组织在二甲苯中停留时间不宜过长，一般透明时间在30分钟左右即可。

六、浸蜡 浸蜡是指组织经过透明作用以后，放入溶化的石蜡中浸渗，使石蜡浸入组织块中，冷却后，才能进行切片。

通常选择熔点在52～56℃之间的石蜡，并视切片时环境的气温而选择。室温高则选用熔点稍高的石蜡，反之，则选用熔点较低的石蜡，这样可防止切片时石蜡太软或易碎裂。浸蜡的过程是：

二甲苯石蜡混合液（1：1）

1小时 二甲苯石蜡混合液（1：2）

1小时

石蜡（1）

1小时30分 石蜡（2）

1小时30分

上述过程可在56℃～58℃恒温箱中进行，含二甲苯的混合液可用磨口小瓶盛装。

七、包埋

包埋就是将已浸渗好的组织包埋于浸渗剂中。根据需要，包埋的方法常有石蜡包埋法和火棉胶包埋法。石蜡包埋法：

（1）先将熔化的石蜡倒入包埋框，用加热的镊子将欲包埋的组织块在蜡液内放置好。注意各组织块之间的距离和每个组织块的位置和方向。

（2）迅速第二次往平皿内倾倒蜡液，淹没组织块。待蜡液出现凝固层后，即轻轻放入冷水盆中或冰箱中使其凝固。石蜡完全凝固后，倒出冷缩的蜡块片，用加热的外科刀，按组织块位置修整蜡片待用。

对于实验动物（狗和兔等）组织，一般的脱水透明和浸蜡时间如下： 处理步骤处理时间（min）处理步骤处理时间（min）① 75%酒精长短不定二甲苯Ⅰ、Ⅱ⑥ 30 ② 85%酒精 120－300 二甲苯Ⅲ⑦ 60

③ 95%酒精Ⅰ和Ⅱ 120－300 56－58℃石蜡⑧ 30 ④无水酒精Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ 30 56－58℃石蜡⑨ 60－120 ⑤无水酒精Ⅲ 60－120 56－58℃石蜡⑩ 120－180

注：摘自病理学技术，人民卫生出版社，王伯，李玉松，黄高，张远强主编。

八、组织切片

不同的切片制备方法，其切片方法也有较大差别，组织切片法包括石蜡切片法、冰冻切片法、火棉胶切片法、石蜡包埋半薄切片法、树脂包埋薄切片法和大组织石蜡切片法等。常用的切片工具包括组织切片机、切片刀和自动磨刀仪器等。以下分别加以叙述。

（一）石蜡切片法

组织经石蜡包埋后制成的蜡块，用切片机制成切片的过程称为石蜡切片法。为现在病理诊断常用的制作切片的方法。在切片前应先切去标本周围过多的石蜡（此过程称为修块）但也不能留得太少，否则易造成组织破坏，连续切片时分片困难。一般切4－6μm的切片，特殊情况可切1－2μm。要观察病变的连续性，可制作连续切片。除此之外，石蜡包埋的组织便于长期保存，因此石蜡切片仍是目前各种切片制作方法中最常用，最普遍的一种方法。

1．切片前的准备

（1）固定后的标本经脱水、透明、浸蜡和包埋后，制成蜡块。高质量的蜡块和锋利的切片刀是保证切片质量的关键环节。检查切片刀是否锋利，简便的方法是用头发在刀锋上碰一下，如一碰即断，说明刀锋锋利。用显微镜观察可确定刀口是否平整，有无缺口。

（2）准备充足的经过处理的清洁载玻片和恒温烤片装置，大中号优质狼毫毛笔和铅笔（用于在载玻片的粗糙端写号），如用普通载玻片，可用碳素墨水和蛋白甘油按3：1体积混合后书写。

2．切片制作过程

（1）将预先修好的组织块先在冰箱中冷却，而后装在切片机固定装置上。将切片刀装在刀架上，刀刃与蜡块表面呈5℃夹角。将蜡块固定，调整蜡块与刀至合适位置，并移动刀架或蜡块固定装置，使蜡块与刀刃接触。

（2）切片多使用轮转式切片机，使用时左手执毛笔，右手旋转切片机转轮。先修出标本，直到组织全部暴露于切面为止，但小标本注意不要修得太多，以免无法切出满意的用于诊断的切片，标本应注意切全。切出蜡片后，用毛笔轻轻地托起，尔后用眼科镊夹起，正面向上放入展片箱（展片温度根据作用的石蜡熔点进行调整，一般低于蜡熔点10～12℃），待切片展平后，即可进行分片和捞片。切片经30%的酒精初展后，再用载玻片捞起放入展片箱更易展平。为减少切片刀与组织块在切片过程中产生的热量，使石蜡保持合适的硬度，切片时可经常用冰块冷却切片刀和组织块，尤其在夏季高温季节更为必要。（3）轮转式切片机切取组织，是由下向上切，为得到完整的切片，防止组织出现刀纹裂缝，应将组织硬脆难切的部分放在上端（如皮肤组织，应将表皮部分向上。而胃肠等组织，应将浆膜面朝上）。

（4）捞片时注意位置，要留出贴标签的空间，并注意整齐美观。捞起切片后，立即写上编号。

（5）切片捞起后，在空气中略微干燥后即可烤片。一般在60℃左右烤箱内烤30min即可，也可用烤片器烤片。血凝块和皮肤组织应及时烤片。但对脑组织待完全晾干后，才能进行烤片。否则，可能产生气泡影响染色。

3．注意事项

（1）组织的取材和固定 取材时，组织块的大小厚薄应适当，过大、过厚的组织，固定液不易渗透，易引起固定不良。过小、过薄的组织，在固定和脱水的过程中易变硬或产生弯曲扭转，同样影响切片质量。陈旧、腐败和干枯的组织不宜制作切片。用陈腐组织制成的切片，往往核浆共染，染色模糊，组织结构不清，无法进行观察。固定不及时和固定不当的组织，染色时常出现核质着色较浅，轮廓不清，出现不同程度的片状发白区。组织固定时，固定液的量应充足，至少要在4倍以上，同时注意组织块不要与容器粘连。至于组织固定的时间，根据具体情况加以掌握。有关固定时应注意的事项，可参见有关章节。（2）组织脱水、透明和浸蜡组织脱水用的各级酒精，应保证相应浓度，以便组织脱水彻底。但无水酒精中，组织块放置时间不宜过长，否则组织过硬，切片困难。遇到此情况，可将组织浸在香柏油中软化，用二甲苯洗去香柏油后，再重新浸蜡和包埋。脱水酒精，尤其是无水酒精中混有水分，则组织脱水不干净。经二甲苯时，组织也无法透明，呈现浑浊。此时应将组织在新的酒精中重新脱水。二甲苯透明也应充分，否则不利于石蜡的浸透。但组织在二甲苯内的时间应严格掌握，时间过长组织易碎，也无法切出好的切片。时间不足，则石蜡不易浸透。浸蜡的温度也不宜过高，时间长短也应加以控制。总之，组织脱水、透明和浸蜡对于切片质量都有一定影响，组织脱水、透明和浸蜡过度，组织块变硬变脆，因此对于小块组织或小动物标本应注意时间。但若时间不够，组织块硬化不够，也不利于切片和染色，因此，应注意各具体环节的操作，并注意保证各种试剂的质量。

（3）切片切片刀要求锋利且无缺口，切片自行卷起多由切片刀不锋利所致，切片刀有缺口时，易造成切片断裂破碎和不完整。骨组织切片时，用重型刀较好。全钢刀或单面钨刀也适合石蜡或火棉胶包埋的骨组织。

（4）切片刀和切片机切片刀放置的倾角以20－30℃为好。倾角过大切片上卷，不能连在一起。过小则切片皱起。应注意维护切片机，防止因螺丝松动产生震动，切片时会造成切片厚薄不均。遇硬化过度的肝、脑、脾等组织时，应轻轻切削，防止由于震动产生空洞现象。（5）特殊要求切片的制作 石蜡切片虽然有很多优点，但制片过程中要经过酒精和二甲苯等有机溶剂处理，因此很易造成组织内抗原性的丧失，在用于免疫组织化学染色时影响结果的准确性。因而有人采用冷冻干燥包埋法，即将新鲜组织低温速冻，利用冷冻干燥机在真空和低温条件下除去组织内的水分，然后用甲醛蒸汽固定干燥后的组织，而后在进行浸蜡、包埋和切片。此法可保存组织内的可溶性物质，防止蛋白质变性和酶的失活，减少抗原的丢失。用于免疫荧光标记、免疫酶标记和放射自显影。

（二）冰冻切片法

冰冻切片在组织学技术中应用广泛，对临床快速病理诊断尤其具有重要意义。另外，因冰冻切片制作时不经各级酒精的脱水，二甲苯的透明等过程，因此对脂肪和类脂的保存较好，在进行脂肪染色和神经组织髓鞘的染色常用。冰冻切片多用于新鲜组织，甲醛固定的组织和低温冰箱冷藏的组织块等。组织不经任何包埋剂而直接放在制冷台上冷却后进行切片。

1．恒冷箱切片 将组织块在恒冷箱的切片机上切片。恒冷箱切片机的种类较多，可根据实际情况加以选用。一般调节温度为－25℃左右。箱内温度下降后，打开观察窗，将组织固着器放置到速冻台上，先放少量OCT或羧甲基纤维素，待冻结后将组织块放上，并在其周围加适量包埋剂，将组织块包埋。组织冻结后，将组织固着器装到切片机上，调整组织的切面与刀刃平行并贴近刀刃，将厚度调至适当位置后，关闭观察窗。初步修出组织切面后，放下抗卷板，开始切片。切出切片用载玻片贴附后，进行吹干或固定。这种切片用于科研和教学的连续切片，效果较好。在切片前，应预先启动进行预冷，同时准备多个冷却台，用于多块组织切片。

2．半导体制冷冰冻切片法 组织块放置在半导体制冷台上，加少许蒸馏水，调好切片的厚度。接通循环流水后，再接通电源，而且在使用的全过程中流水不能中断，关闭电路后，才能停水。还应注意电源正负极不能接反，用整流电源控制温度。冰冻组织周围的水不宜过多，用手检查组织块的硬度，当可切成厚薄一致的切片时，即可切片。切片用毛笔展平后，立即用载玻片贴附，待切片刚要融化时，即刻入固定液内固定1min。已固定的组织切片，收集于清水中。根据目的进行染色。暂时不染色的切片，用载玻片吸附。

3．甲醇制冷器 制冷箱为附有带导管的制冷台和制冷刀的甲醇循环装置，其冷却速度较快，属开放式，做一般常规冰冻切片用。

4．二氧化碳冰冻法 将组织块用蒸馏水洗后，放在冰冻切片机的冷冻台上，加蒸馏水少许。打开冷冻台的二氧化碳开关，二氧化碳气体喷出，待组织出现冷霜时，关闭二氧化碳，即可切片。组织冷冻过硬易碎，若冷冻不够，组织块硬度不足，切片呈粥糜状，无法成片，应用间歇冷却法继续冷却。硬度一般在刚开始解冻时最适合，应迅速切片。

5．冰冻切片粘片法冰冻切片粘片法基本按石蜡切片的粘片处理，但烤片温度不宜超过40℃。烤干后立即取出，温度过高，时间过长，则切片易碎。烤干后用70%酒精和自来水略洗后即可染色。

九、苏木精－伊红染色方法

苏木精-伊红染色方法，简称HE染色方法，是生物学和医学的细胞与组织学最广泛应用的染色方法。在病理学实验室中称为常规染色方法。病理细胞和组织学的诊断，教学和研究都是用HE染色方法观察正常和病变组织的形态结构。因此病理学工作者必需学习和掌握这种染色方法。

（一）HE染色的基本原理

1．细胞核染色的原理

细胞核内的染色质主要是去氧核糖核酸（DNA），DNA的双螺旋结构中，两条链上的磷酸基向外，带负电荷，呈酸性，很容易与带正电荷的苏木精硷性染料以离子键或氢键结合而染色。苏木精在碱性染料中呈蓝色，所以细胞核被染成蓝色。

2．细胞浆染色的原理

细胞浆内主要成分是蛋白质，在染液中加入醋酸使胞浆带正电荷（阳离子），就可被带负电荷（阴离子）的染料染色。伊红Y是一种化学合成的酸性染料，在水中离解成带负电荷的阴离子，与蛋白质的氨基正电荷（阳离子）结合而使细胞浆染色，细胞浆、红细胞、肌肉、结缔组织、嗜伊红颗粒等被染成不同程度的红色或粉红色，与蓝色的细胞核形成鲜明的对比。伊红是细胞浆的良好染料。

随着科学技术快速发展和电子计算机的广泛应用，染色自动仪器的出现，许多实验室已用全自动染色机代替人工染色。

（二）人工操作苏木精伊红染色方法

1．染色步骤 二甲苯I脱蜡10min.二甲苯II脱蜡5min。

无水乙醇洗去二甲苯1min×2次。

95%酒精1min。

90%酒精1min。

85%酒精1min。自来水洗2min。

苏木精染色1min至5min。自来水洗1min。

1%盐酸酒精分化20s。自来水洗1min。

稀氨水（1%）反蓝30s。自来水洗或蒸馏水洗1min。伊红染色20s至5min。自来水洗30s。

85%酒精脱水20s。

90%酒精30s。

95%I酒精1min。

95%II酒精1min。无水乙醇I 2min。无水乙醇II 2min。二甲苯I 2min。二甲苯II 2min。二甲苯III 2min。

中性树胶或加拿大树胶封片。

2．染色结果

细胞核呈蓝色，细胞浆、肌肉、结缔组织、红细胞和嗜伊红颗粒呈不同程度的红色。钙盐和各种微生物也可染成蓝色或紫蓝色。

（三）自动染色机苏木精伊红染色程序

1．二甲苯I 10min。

2．二甲苯II 10min。

3．无水乙醇1min。

4．无水乙醇1min。

5．95%酒精I 1min。

6．95%酒精II 1min。

7．90%酒精I 1min。

8．80%酒精1min。

9．自来水洗1min。

10．苏木精染色1至5min。

11．自来水洗1min。

12．1%盐酸酒精分化30s。

13．自来水洗5min。

14．伊红染色30s至5min。

15．自来水洗30s。

16．85%酒精20s。

17．90%酒精30s。

18．95%酒精1min。

19．95%酒精1min。

20．无水乙醇I 2min。

21．无水乙醇II 2min。

22．二甲苯I 2min。

23．二甲苯II 2min。

24．二甲苯III 2min。

25．中性树胶或加拿大树胶封片。

（四）冰冻切片苏木精伊红染色

1．恒冷箱冰冻切片，粘贴在载玻片上，用95%酒精95ml和冰醋酸5ml的混合固定液固定1min。自来水洗。

2．苏木精染色1～2min。

3．自来水洗30s。

4．1%盐酸酒精分化20s。

5．自来水洗20s。

6．稀氨水30s。

7．自来水洗20s。

8．伊红染色20s～1min。

9．自来水洗10s。

10．85%酒精20s。

11．90%酒精30s。

12．95%酒精1min。

13．无水乙醇I 1min。

14．无水乙醇II 2min。

15．二甲苯I 1min。

16．二甲苯II 2min。

17．二甲苯III 2min。

18．中性树胶或加拿大树胶封片。

（五）染色液的配制

1．苏木精（素）

苏木精是一种纯天然染料，是从苏木素树提炼出来的，苏木树主产墨西哥的坎偑切，苏木精的染色性能差，经过一百多年精心加工配制，现用的苏木精配方，染色性能好，保持时间长，是世界上唯一的常规细胞核染料，2．苏木精的配制

苏木精的配方很多，可根据不同需要选用，Harris配方最常用。（1）Harris苏木精的配制 苏木精1g 硫酸铝钾15g 无水乙醇10ml 蒸馏水200ml

先用蒸馏水加热溶解硫酸铝钾，用无水乙醇溶解苏木精再倒入已溶解的硫酸铝钾蒸馏水中，煮沸1min后，稍冷却，慢慢加入红色氧化汞0.5g，继续加热至染液变为紫红色，用纱布盖瓶口，用前滤纸过滤后每100ml加冰醋酸5ml。（2）Mayer苏木精改良配法

A液 苏木精2g

无水乙醇40ml

B液

硫酸铝钾100g 蒸馏水600ml

稍加热使硫酸铝钾在水中溶解，将苏木精溶于酒精中，再将A液与B液混合煮沸2min。用蒸馏水补足600ml，加入400mg碘酸钠充分混匀，苏木精染液呈紫红色。（3）Gill改良苏木精染液的配制 苏木精2g

无水乙醇250ml 硫酸铝钾17g 蒸馏水750ml 碘酸钠0.2g 冰醋酸20ml

先将苏木精溶于无水乙醇，再将硫酸铝钾溶于蒸馏水中。两液溶解后将其混合，加入碘酸钠待苏木精氧化成紫红色，再加入冰醋酸。

3．伊红溶液的配制（1）水溶性伊红 伊红Y0.5－1g 蒸馏水100ml

先将水溶性伊红加入蒸馏水中，用玻璃棒将伊红搅起泡沫后过滤，每100ml加冰醋酸1滴。（2）乙醇性伊红液的配制 伊红Y 0.5～1g

90%酒精100ml

先将伊红溶于酒精中，用玻璃棒研碎溶解后，每100ml加冰醋酸1滴。用乙醇性伊红液染细胞浆后不可经水洗直接用85%酒精脱水。

4．盐酸酒精分化液的配制 浓盐酸0.5～1ml

75%酒精99ml

此液用一段时间后需要延长或更换液体，新液分化时间要短。

5．染色中注意事项（1）脱蜡 石蜡切片必需经过脱蜡后才能染色，脱蜡前切片要经烘烤，这样使组织与玻璃片粘贴牢固。组织切片脱蜡应彻底，脱蜡好坏主要取决于二甲苯的温度和时间，所有的时间都是指新的二甲苯在室温25℃以下时，如果二甲苯是用过一段时间，切片又比较厚，室温低应增加脱蜡时间，脱蜡不净是影响染色不良的重要原因之一。（2）染色

石蜡切片经水洗后放入Harris苏木精染色，一般情况下在新配的苏木精溶液中只需要染1min左右，应根据染片的多少，逐步把染色时间延长。苏木精染色后，不宜在水中和盐酸酒精停留过长，切片分化程度应在镜下观察，分化过度，应水洗后重新在苏木精中染色，再水洗分化和使切片在自来水或稀氨水中充分变蓝。

新配的伊红染色快，切片染色不宜过长，应根据染切片的多少逐步延长染色时间，切片经伊红染后，水洗时间要短。（3）脱水

切片经过染色后，通过各级酒精脱水，首先从低浓度到高浓度，低浓度酒精对伊红有分化作用，切片经过低浓度时间要短，向高浓度时逐步延长脱水时间；脱水不彻底，使切片发雾，在显微镜下组织结构模糊不清。（4）透明与封片

石蜡组织切片染色经过脱水后必须经二甲苯处理，使切片透明，才能用树胶封片。常用切片封片胶有国产的中性树胶，光学树胶，加拿大树胶和合成树脂（DPX）。在封片时，树胶不能太稀或太稠，不能滴加的太多或太少，太稀或太少切片容易空泡，树胶也不可太多，不要使树胶溢出玻片四周太多。标签要附贴牢固。封片中不能对着切片呼气。（5）常规石蜡切片和HE染色标本的质量标准（全国统一评定标准）①切片完整，厚度4－6um，薄厚均匀，无褶无刀痕。②染色核浆分明，红蓝适度，透明洁净，封裱美观。