实验研究_主要实验研究

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一、基因的克隆

提取小鼠视网膜RNA，然后反转录为cDNA。

RNA电泳

用PCR扩增。先以检测引物EL4d检测基因表达情况。引物如下： EL4d-s 5 TAAGCACGCTCTATCTCCTGTTCG 3

Tm 63.1 EL4d-a 5 TCCAAATACTCAACGCCTTTCG

Tm 62.0

268bp 扩增时使用了55.6, 56.5，58.4，60.4，62等5个梯度，结果每个温度均出现目的条带，说明EL4基因的表达丰度良好。

再以全长基因扩增引物EL4和EL4r同时扩增目的基因。两对引物如下： EL4-s CAAGATGGGGCTGCTGGACTCAG

Tm 67.8 EL4-a TCACATTGGGGTTGCTTTGGTCTG

Tm 67.9

1190bp EL4r-s ATCGGTACCCAAGATGGGGCTGCTGGACTCAG

Tm 67.8 EL4r-a ATAGAATTCAATTTACTCTCCTTTTGGCTTCCCGT

Tm 67.8

956 bp 扩增时使用了56.1, 58.3，59.7，62.6，65.5等5个梯度摸条件，结果每个温度均出现目的条带。但低温有杂带，高温特异性强。由此可见，直接用带有内切酶的克隆引物EL4r扩增基因即可，用65℃最佳。

引物EL4

M2000

引物EL4r

质粒电泳

空

M2000