与耐药机制有关药敏试验的规范化.精讲_药敏试验耐药
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与耐药机制有关药敏试验的规范化
与耐药机制有关的药敏试验的规范化操作。
前言，细菌耐药已成为一个全球性的问题，已对人类健康构成严重的威胁。耐药细菌感染导致病人住院时间延长、费用增加、死亡率增高，同时也给临床医生抗感染治疗带来困难。因此，检测细菌耐药机制是当今细菌学的一个重要课题，也是正确指导临床医生合理使用抗生素的重要依据。
在细菌耐药机制检测方面，包括分子生物学等许多实验方法被广泛运用。但这些方法的技术要求普遍较高，大多数被用于基础研究。真正应用到临床微生物实验室的试验方法，要求操作简便、重复性好，结果准确、可靠，试验成本不能太高。
我国卫生部于1998年规定：我国药敏试验暂按CLSI历年颁布的所有微生物药敏试验文件作为部颁标准，此决定至今未改变。本节所讲内容，主要是CLSI（M100-S22）文件推荐的临床微生物实验室常规检测方法。也是我们从事临床微生物检验技术人员必须掌握的内容。
包括两个内容，第一个就是革兰阳性球菌耐药机制的实验室检测项目。第二个内容是革兰氏阴性发酵细菌以及其他细菌的耐药机制。
首先介绍青霉素酶的检测。检测青霉素酶的方法有碘量法、酸量法和显色头孢菌素法等，临床应用较多的是显色头孢菌素法。其原理是将受菌株与头孢硝噻吩作用一段时间后，如受试菌株产生青霉素酶，则可水解头孢硝噻吩的 β-内酰胺环，产生由黄色向红色转变的颜色反应，即为青霉素酶试验阳性。头孢硝噻吩法是目前检测嗜血杆菌属、淋病奈瑟菌、卡他莫拉菌和葡萄球菌属产生 β-内酰胺酶的最好方法，具有快速、灵敏和简便的特点，但价格相对较昂贵。
方法，检测时用1滴无菌水将Nitrocefin纸片湿润，将受试菌直接涂抹于湿润后的Nitrocefin纸片上，即可观察颜色的反应，产生红色者为产酶阳性。质控菌株，阴性株为金黄色葡萄球菌ATCC25923；阳性株为金黄色葡萄球菌ATCC29213。注意事项，目前实验室多采用BD公司生产的非头孢硝噻吩显色头孢菌素纸片，这个纸片进行 β-内酰胺酶测试，效果稍好于头孢硝噻吩，可降低金黄色葡萄球菌阳性结果的反应时间。
葡萄球菌可诱导 β —内酰胺酶的检测。这项内容呢是 CLSIM100 — S21。方法，如果青霉素对葡萄球菌的MIC值小于等于0.12每毫升微克的时候 或者抑菌环直径大于等于 29毫米 的时候，应该对其进行可诱导 β-内酰胺酶的检测。将待检菌株传代到血琼脂平板或者是MHA琼脂平板上，用苯唑西林纸片或者是头孢西丁纸片作为诱导剂，具体方法可参照纸片扩散法药敏试验，大气环境孵育16到18小时后，检测抑菌圈周边细菌的产酶情况。可诱导 β-内酰胺酶检测阳性的菌株，应报告对不耐酶青霉素耐药。质控菌株，阴性株用金黄色葡萄球菌 ATCC25923；阳性株用金黄色葡萄球菌 ATCC29213。
CXIM100 — S22 文件中增加了用10单位青霉素纸片作为诱导剂检测葡萄球菌可诱导 β —内酰胺酶的方法，具体方法同苯唑西林和头孢西丁纸片法。
第二个内容介绍甲氧西林耐药葡萄球菌，也就是MRS检测。检测mecA基因和其表达的青霉素结合蛋白 2a，是预报葡萄球菌对甲氧西林耐药最准确的方法，它也被用于证实从严重感染病人分离的葡萄球菌纸片扩散法药敏试验结果。携带mecA 基因或者是产PBP 2a 的葡萄球菌分离株，应报告对苯唑西林耐药。不携带mecA或不产PBP 2a 菌株应报告对苯唑西林敏感。由于罕见的非mecA基因介导的苯唑西林耐药机制，在纸片扩散法确定为苯唑西林耐药时，应加测苯唑西林MIC，若MIC值大于等于4个每毫升微克，即使mecA基因和PBP 2a 检测为阴性，也应报告苯唑西林耐药。可用纸片扩散法检测这些菌株对头孢西丁的敏感性。
苯唑西林纸片扩散法筛选试验，方法，使用含1个微克的苯唑西林纸片，而不是甲氧西林或萘夫西林来检测金黄色葡萄球菌对甲氧西林的耐药性。用直接菌落悬液法制备接种物，配成0.5麦氏比浊浓度菌液，接种MH琼脂平板，待琼脂表面的水份干后，贴苯唑西林纸片，于33至35度，大气环境孵育24小时，检测抑菌圈直径。结果判断，按CLSI解释标准判断结果。金黄色葡萄球菌抑菌圈直径小于等于10个毫米为耐药，大于 13毫米 为敏感。质控菌株用金黄色葡萄球菌ATCC25923。
注意事项，试验温度超过35度不能检测出MRS；孵育时间不能少于24小时；在透射光下仔细观察苯唑西林纸片周围抑菌圈内有没有细小菌落或者轻微弥漫生长，如果有生长提示苯唑西林耐药；如果金黄色葡萄球菌纸片扩散法结果中，结果为中介时也就是直径在11到 12毫米 时，或者 MIC 为0.5到2个每毫升微克的表皮葡萄球菌以外的其他凝固酶阴性葡萄球菌引起严重感染时，必须进行mecA基因或者是PBP 2a 测定，或者是头孢西丁纸片试验、苯唑西林MIC试验或者是苯唑西林盐琼脂筛选试验，来确定是否为MRS菌株，选择其中一种试验结果进行报告。
苯唑西林盐琼脂筛选试验，试验用的MH琼脂中含苯唑西林每毫升6个微克，并添加有4%的氯化钠，或者是每毫升0.68摩尔。方法，直接菌落悬浮液获得0.5麦氏单位浓度。进行试验时，使用1微升接种环蘸取菌液，在平板上涂成直径10到 15毫米 斑点。替代方法，用棉拭子蘸菌液涂成类似大小斑点或划满四分之一区域。将琼脂平板置33到35度，大气环境孵育24小时后用透射光检查有无细菌生长，任何生长都表示对苯唑西林耐药。注意事项，试验温度超过35度不能检测出MRS；为从凝固酶阴性葡萄球菌中检测出甲氧西林耐药菌株，需将琼脂平板孵育48小时。质控菌株，敏感株ATCC29213；耐药株ATCC43300。
头孢西丁纸片法。方法，应用标准的纸片扩散法试验条件接种MH琼脂平板，使用含30微克头孢西丁纸片，33到35度大气环境孵育。金黄色葡萄球菌和路邓葡萄球菌孵育16到18小时报告结果，凝固酶阴性葡萄球菌除路邓葡萄球菌以外要孵育24小时，如耐药则在孵育18小时后可报告结果。使用反射光阅读头孢西丁纸片试验结果。结果判读，头孢西丁对金黄色葡萄球菌和路邓葡萄球菌抑菌圈直径小于等于 21毫米 时，应报告对苯唑西林耐药，大于等于 22毫米 应报告对苯唑西林敏感。除路邓葡萄球菌外其他凝固酶阴性葡萄球菌抑菌圈直径小于等于 24毫米 时，应报告对苯唑西林耐药，大于等于 25毫米 应报告对苯唑西林敏感。注意事项，试验温度超过35度不能检测出MRS；检测凝固酶阴性葡萄球菌对苯唑西林的耐药性，头孢西丁纸片试验是首选方法，因为头孢西丁较苯唑西林的敏感性高。
mecA基因及PBP 2a 检测，方法，可采用乳胶凝集或分子生物学等方法进行检测。结果判断，mecA基因或PBP 2a 检测阳性的葡萄球菌分离株，应报告对苯唑西林和甲氧西林耐药。不携带mecA基因或不产PBP 2a 菌株应报告对苯唑西林和甲氧西林敏感。质控菌株，mecA阴性用ATCC29213；mecA阳性用ATCC43300。苯唑西林MIC试验方法，可采用琼脂稀释法、肉汤稀释法或Etest等方法进行检测。结果判读，若苯唑西林MIC值大于等于每毫升4个微克，即使mecA基因和PBP 2a 检测为阴性，也应报苯唑西林耐药。可同时用纸片扩散法检测这些菌株对头孢西丁的敏感性。注意事项，一，试验温度超过35度不能检测出MRS；二，孵育时间不能少于24小时；三，在透射光下观察琼脂上有无细小菌落或轻微弥漫生长，如果有生长提示苯唑西林耐药。质控菌株，敏感株ATCC29213；耐药株 A TCC43300。
MRS的临床报告，对于甲氧西林耐药的葡萄球菌即 M RS，应报告对所有 β-内酰胺类药物耐药，而不考虑这些药物的体外试验结果是否敏感。因为大多数文献报告了MRS感染对 β-内酰胺类治疗反应差或者没有令人信服的临床数据证实这些药的临床效果。
万古霉素耐药葡萄球菌的筛选试验，一，纸片筛选法；方法，应用标准的纸片扩散法试验条件接种MH琼脂平板，使用含30微克万古霉素纸片，35度加减2度，大气环境孵育24小时。结果判断，CLSI M100-S19中已经取消了万古霉素对葡萄球菌的纸片扩散法判断折点。纸片扩散法只能检测VanA基因型的万古霉素耐药金黄色葡萄球菌，这种菌株无抑菌圈，应确认该菌株的鉴定结果。对未测定万古霉素MIC，而万古霉素抑菌圈直径大于等于 7毫米 的葡萄球菌，不能报告其对万古霉素敏感。
注意事项，纸片扩散法检测万古霉素结果不可靠。纸片扩散法不能区分万古霉素敏感，也就是MIC范围在0.5至2个微克每毫升和万古霉素敏感性减低的菌株，也就是MIC值在4到8每毫升微克。万古霉素耐药金黄色葡萄球菌MIC大于16每毫升微克，在万古霉素纸片周围仅见轻微生长。因此，用含每毫升6个微克万古霉素的BHI 琼脂平板筛选平板，可提高检测万古霉素中介和万古霉素耐药金黄色葡萄球菌的敏感性。
琼脂筛选法，用含每毫升6个微克万古霉素脑心浸液琼脂对耐万古霉素金黄色葡萄球菌进行筛选试验。方法，直接菌落悬液获得0.5 麦氏浊度，使用微量吸管吸取菌液10个微升，点种琼脂平板表面。替代方法，用棉拭子蘸菌液，挤去多余的菌液，在平板上涂成直径10 到 15毫米 斑点或在部分区域划线接种，35加减2度，大气环境孵育24小时，观察结果。结果判断，在透射光下仔细观察，如果点种位置出现1个以上菌落，推测菌株对万古霉素敏感性减低。注意事项，用含每毫升6个微克万古霉素BHI琼脂筛选平板，可提高检测万古霉素耐药金黄色葡萄球菌的敏感性。但琼脂筛选法不能可靠检测VISA，这是葡萄球菌对万古霉素中介的菌株，MIC值等于4个每毫升微克菌株不生长。质控，敏感株 ATCC29212；耐药株 ATCC51299。
万古霉素MIC确认试验。方法，可采用琼脂或肉汤稀释法或Etest等方法进行检测。结果判断，金黄色葡萄球菌MIC值小于等于每毫升2个微克为敏感，MIC值在4到8每毫升微克为敏感性降低，MIC值大于16每毫升微克为耐药；凝固酶阴性葡萄球菌MIC值小于等于每毫升4个微克为敏感，MIC值在4到16每毫升微克为敏感性降低，MIC值大于等于32每毫升微克为耐药。注意事项，检测到万古霉素MIC值大于等于每毫升8个微克的金黄色葡萄球菌，或者是MIC值大于等于每毫升32微克的凝固酶阴性葡萄球菌，应送参考实验室进一步确认。
诱导性克林霉素耐药试验检测，耐药机制，对大环内酯耐药的葡萄球菌或者是 β-溶血链球菌，可能存在有结构性或者是诱导性对克林霉素的耐药，或者只对大环内酯类耐药。检测方法，诱导克林霉素耐药试验又称“D”抑菌环试验。配养基，用 MH 琼脂，加或不加5%的绵羊血。接种物，直接菌悬液法，相当于0.5麦氏标准浓度。孵育，35度加减2度，大气环境16到18小时。方法，贴红霉素纸片和克林霉素纸片，纸片间距离15至26毫米。结果判断，若靠近红霉素纸片一侧克林霉素的抑菌环出现“截平”现象，也就是称为“D”抑菌环，则菌株存在克林霉素诱导耐药，应报告对“克林霉素耐药”。在报告单中可注明“经诱导克林霉素耐药试验推测此菌株对克林霉素耐药，在某些病人中克林霉素可能仍有效”。若无“截平”现象，则应报告菌株对克林霉素敏感。
质控菌株，阴性对照，金黄色葡萄球菌 ATCC 25923或者是金黄色葡萄球菌 ATCC BAA-976。阳性对照，金黄色葡萄球菌 ATCC BAA-977。
金黄色葡萄球菌，高水平莫匹罗星耐药性检测。纸片扩散法，方法，用标准的纸片扩散法试验条件接种MH琼脂平板，使用含200微克莫匹罗星纸片，35度加减2度，大气环境孵育24小时。在透射光下仔细观察纸片周围抑菌圈内有无细小菌落或轻微弥漫生长，如果有生长提示莫匹罗星耐药。结果判读，无抑菌圈等于高水平莫匹罗星耐药； 有抑菌圈等于非高水平莫匹罗星耐药。质控菌株，ATCC25923莫匹罗星抑菌圈直径在29至38毫米；ATCC BAA1708无抑菌圈。
肉汤微量稀释法，用调节阳离子M-H肉汤配成单一的莫匹罗星，也就是每毫升256微克试验孔。方法，应用标准的肉汤微量稀释法试验条件进行接种，在35加减2度，大气环境孵育24小时。结果判读，在透射光下进行判读。如果有生长等于高水平莫匹罗星耐药；无生长等于非高水平莫匹罗星耐药。质控菌株ATCC 29213，MIC 值应该在0.06至0.5每毫升微克；ATCC 29212 MIC 值应该在16到128每毫升微克；ATCC BAA1708应该在256每毫升微克生长。解释，尽管CLSI M100-S22中未提供莫匹罗星的折点，但纸片扩散法和MIC筛选试验能识别出莫匹罗星MIC值大于512每毫升微克的菌株即高水平耐药株。
肠球菌对青霉素或者氨苄西林耐药性检测。肠球菌对青霉素和氨苄西林耐药是因为产生了低亲和力的青霉素结合蛋白，个别菌株是产生 β-内酰胺酶。纸片扩散法药敏试验可准确测定PBP改变的菌株，但对产 β-内酰胺酶的菌株结果不可靠。此类菌株应检测 β-内酰胺酶。
高水平氨基糖苷类耐药肠球菌的检测。方法，用高浓度庆大霉素也就是每片120微克，或者是链霉素每片300微克纸片可以筛选出此类耐药性。结果判断，无抑菌圈为耐药，抑菌圈直径大于等于 10毫米 时表示为非高水平耐药。抑菌圈直径在7到 9毫米 的菌株应使用稀释筛选试验进行检测。对于庆大霉素，稀释法的MIC值大于每毫升500微克即为耐药。对于链霉素，微量肉汤稀释法的MIC值大于每毫升1000微克，琼脂稀释法的MIC值大于每毫升2000微克，即为耐药。
HLAR的临床意义：对高浓度氨基糖苷类敏感，表示氨基糖苷类与作用于细胞壁的抗菌药物联合用药时对该肠球菌菌株将具有协同作用，也是敏感的。对氨基糖苷类高水平耐药，表示当青霉素或糖肽类与一种氨基糖苷类抗生素联合用药时对该肠球菌菌株不会产生协同效果。
万古霉素耐药肠球菌的检测。要想使用纸片扩散法准确检测出耐万古霉素肠球菌，需要将平板孵育满24小时而不是16到18小时,借透射光仔细检查抑菌圈内有无细小菌落或弥漫生长。纸片扩散法结果为中介度也就是在8到 16毫米 时应选MIC值。可采用琼脂稀释法、肉汤稀释法或Etest等方法进行MIC值的检测。
筛选试验，用每毫升6个微克万古霉素的脑心浸液琼脂筛选试验，35加减2度，大气环境孵育24小时，点种位置出现1个以上菌落，推测菌株对万古霉素敏感性减低。
青霉素耐药肺炎链球菌的检测。一，肺炎链球菌的耐药机制，青霉素耐药肺炎链球菌的耐药机制是肺炎链球菌有6种青霉素结合蛋白发生改变，改变后使PBP与青霉素的结合力下降，因而导致耐药。
二，纸片扩散法检测。方法，使用含1个微克的苯唑西林纸片而不是青霉素纸片，来检测肺炎链球菌对青霉素的耐药性。培养基用 MH 琼脂加5%绵羊血。接种物，使用绵羊血琼脂平板上过夜生长的菌落制备接种物，采用直接菌落悬液法，相当于0.5麦氏标准。孵育，35加减2度，在5%二氧化碳环境，孵育20到24小时。结果判读，苯唑西林大于等于 20毫米 对青霉素敏感，苯唑西林小于等于 19毫米 时，应测定青霉素、头孢噻肟、头孢曲松和美罗培南的MIC值。质控菌株用肺炎链球菌 ATCC 49619。
结果报告，当苯唑西林抑菌圈大于等于 20毫米 时可报告肺炎球菌对青霉素敏感，并同时可报告氨苄西林、阿莫西林、阿莫西林加克拉维酸、头孢克罗、头孢地尼、头孢吡肟、头孢他美、头孢克肟、头孢噻肟、头孢丙烯、头孢曲松、头孢呋辛、头孢泊肟、头孢唑肟、亚胺培南、氯碳头孢和美罗培南敏感，而不需要再检测这些药物的敏感性。当苯唑西林的抑菌圈直径小于等于 19毫米 的菌株应当检测青霉素、头孢噻肟或头孢曲松及美罗培南的MIC值，因为抑菌环直径小于等于 19毫米 时，可以发生在青霉素耐药、中介或敏感的某些菌株中，不能仅仅根据苯唑西林的抑菌环直径小于等于 19毫米，就报告对青霉素耐药或中介。
肉汤稀释法检测。方法，用加2%到5%融血马血的调节阳离子M-H肉汤做肺炎链球菌的稀释法药敏试验，35加减2度，大气环境孵育20到24小时，琼脂稀释法应放在二氧化碳环境下孵育。结果判读，一，口服青霉素V，青霉素MIC值小于等于0.06每毫升微克时为敏感，MIC 值大于等于每毫升2个微克为耐药。二，青霉素注射液，脑脊液分离株，青霉素MIC值小于等于0.06每毫升微克为敏感，MIC 值大于等于0.12每毫升微克为耐药。非脑脊液分离株，青霉素MIC值小于等于每毫升2个微克为敏感，MIC值大于等于每毫升8个微克为耐药。质控菌株，肺炎链球菌ATCC 49619。
第二部分，β-内酰胺酶介导的革兰阴性发酵细菌的耐药机制检测。革兰阴性发酵细菌对 β-内酰胺类抗生素的主要耐药机制，一，产生 β-内酰胺酶水解灭活药物；二，细菌外膜通透性下降；三，主动泵出药物。其中产生 β-内酰胺酶是革兰阴性发酵细菌对 β-内酰胺类抗生素耐药的主要原因。
临床上重要的 β-内酰胺酶有以下几种：一，超广谱 β-内酰胺酶，也就是ESB L ；二，头孢菌素酶，也就是AmpC酶；三，碳青霉烯酶，主要包括KPC酶。
超广谱 β-内酰胺酶的检测。CLSI根据PK-PD性能评价和有限的临床资料，首次于2010年1月也就是 CLSI M100-S20文件修订了头孢菌素和氨曲南的解释标准。因此，在使用新修订的解释标准时不需要常规检测ESBL，除非是在使用旧的解释标准或者是为了流行病学调查以及感染控制的目的仍需要检测ESBL。初筛试验，按常规的标准呢纸片扩散法进行操作对肺炎克雷伯菌、产酸克雷伯菌和大肠埃希菌，如果下列纸片抑菌圈直径，提示菌株可能产生 ESBL。对奇异变形杆菌抑菌圈直径和上述菌有所不同。
按常规的标准肉汤稀释法进行操作。大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌判断标准：头孢他啶、氨曲南、头孢曲松或头孢噻肟任何一种药物对的MIC值大于等于每毫升2个微克，头孢泊肟 MIC 值大于每毫升8个微克，提示菌株可能产生 ESBL。奇异变形杆菌判断标准：头孢泊肟、头孢他啶或头孢噻肟MIC值大于每毫升2个微克，提示菌株可能产生ESBL。
双纸片协同法。按照常规的纸片扩散法在MH琼脂上涂布好受试菌，先在琼脂平板中心贴上阿莫西林加克拉维酸纸片，然后在其上下左右贴上头孢他啶、头孢曲松、头孢噻肟和氨曲南纸片，各纸片中心距复合纸片中心距离为20到 30毫米，35加减2度，大气环境孵育16到18小时。结果解释，如周围4个药物纸片，其中任何一个抑菌圈在靠近复合剂纸片一侧的边缘出现扩大或加强，说明该菌株产ESBL。
扩散法质控，ESBL阴性质控用大肠埃希菌ATCC 25922。ESBL阳性质控肺炎克雷伯菌ATCC 700603。
微量肉汤稀释法初筛试验。方法用调节阳离子M-H肉汤，大肠埃希菌、肺炎克雷伯菌和产酸克雷伯菌选用，头孢他啶每毫升1个微克，氨曲南每毫升1个微克，头孢曲松每毫升1个微克或头孢噻肟每毫升1个微克。奇异变形杆菌选用头孢泊肟每毫升1个微克或头孢他啶每毫升1个微克或头孢噻肟每毫升1个微克。35加减2度，大气环境孵育16到20小时。结果判断如果生长提示菌株产ESBL。注意事项，使用一种以上的药物进行检测可提高检测的敏感性。质控菌株，ATCC 25922不太明显；肺炎克雷伯菌ATCC 700603的生长平等。
ESBL表型确证试验。纸片扩散法，使用每片含30微克的头孢他啶、头孢噻肟和头孢他啶加克拉维酸、头孢噻肟加克拉维酸的复合剂纸片进行试验，当任何一种复合纸片抑菌圈直径大于或等于其单独药敏纸片抑菌圈直径 5毫米，可确认该菌株产ESBL。质控菌株大肠埃希菌ATCC 25922小于等于2个毫米，肺炎克雷伯菌ATCC 700603，头孢他啶加克拉维酸大于等于 5毫米，头孢噻肟加克拉维酸大于等于 3毫米。
表型确认试验。琼脂稀释法：使用头孢他啶 MIC 范围在0.25到128每毫升微克、头孢他啶加克拉维酸范围在0.25到4，128到4每毫升微克、头孢噻肟和头孢噻肟加克拉维酸进行MIC测试，当与克拉维酸联合用药，MIC小于或等于单独用药药物MIC 3个倍比稀释度，也就是8倍浓度，可确认该菌株产ESBL。
稀释法质控，ESBL阴性质控，大肠埃希菌ATCC25922；ESBL阳性质控，肺炎克雷伯菌ATCC700603。
头孢菌素酶检测，对于头孢菌素酶，CLSI酶目前还没有可供推荐的方法进行检测，也没有相应的判断标准。目前用于头孢菌素酶定性的检测方法很多，主要有以下几种。一，单纸片扩散法；二，双纸片协同法；三，双纸片增效试验；四，三维试验法。
碳青霉烯酶的测定。碳青霉烯酶定义，指所有能水解亚胺培南或美罗培南等碳青霉烯类抗生素的一类 β 内酰胺酶，分别属于Ambler分类A类、B类、D类酶，包括KPC β 内酰胺酶和金属酶。CL SI目前还没有可提供推荐用于临床实验室检测金属酶的方法，但是2009年的CLSI M100-S19文件中增加了对KPC β 内酰胺酶的检测方法，即改良的三维方法，即改良的测序试验。
KPC酶检测。2001年首次报道从肺炎克雷伯中分离到KPC-1，它属于Bush分类法中的Ⅱ类 2f 组，Ambler分子分类中的属于A类,克拉维酸对其活性有抑制作用。KPC β 内酰胺酶目前已有10种亚型，包括KPC-1至KPC-10，他们之间只有个别氨基酸发生了突变。在多个菌属中都有报道。主要为质粒介导，但在阴沟肠杆菌中可由染色体介导。国外报道，产KPC β 内酰胺酶菌株即可表现为对碳氢霉烯类抗生素耐药，也可表现为中介或敏感，并存在接种效应，这就增加了对其识别的难度。
用于KPC酶定性的检测方法主要有以下几种：一，3-氨基苯硼酸双纸片协同及增效试验；二，改良三维试验法；三，分子生物学方法。
纸片筛选法，选用厄他培南、美罗培南，亚胺培南不作为碳青霉烯酶筛选用药物。一，3-氨基苯硼酸双纸片协同及增效试验。方法，将0.5麦氏单位的浓度待检菌液涂抹于MH琼脂平板上，琼脂稍干后，把含每片600微克的3-氨基苯硼酸纸片贴于MH平板中间，于纸片周围分别贴上含厄他培南和美罗培南纸片，纸片中心距离为 20毫米，置35加减2度，大气环境孵育16到18小时，有协同现象出现为MBL阳性。
改良的Hodge试验。改良 Hodge 试验是碳青霉烯酶表型检测方法，用于检测KPC的敏感性以及特异性均大于90%，但检测其他碳青霉烯酶时，敏感性及特异性变化较大。方法，将0.5麦氏标准浓度的大肠埃希菌ATCC 25922菌液经1:10稀释后涂抹于MH琼脂平板上，待琼脂稍干后，贴一片厄他培南或美罗培南纸片于平板中央，直径为 90毫米 平板可贴1张纸片，直径为 150毫米 平板可以贴4张，用接种环刮取待检菌沿底物纸片边缘向外划直线接种，每张底物纸片可测试1株待检菌株和2株质控菌株，划线至少20到 25毫米 长，置35加减2度，大气环境孵育16到18小时。出现失状菌苔者为阳性，反之为阴性。
质量控制，每次试验需检测阳性和阴性质控菌株；阳性菌株用肺炎克雷伯菌 ATCC BAA —1705，阴性菌用 ATCC BAA —1706。
根据CLSI于2010年6月也就是M100-S20-U文件首次公布的新的碳青霉烯类解释标准，常规试验不再需要初筛试验和确认试验，为了流行病学调查或感染控制目的测试菌株可使用MHT，但对于MHT阳性菌株不需要更改碳青霉烯类敏感试验结果的解释。
金属 β —内酰胺酶的测定。定义，活性部位带金属离子的酶称为金属 β-内酰胺酶，这类酶不仅能水解碳青霉烯类而且能够水解其他 β —内酰胺类抗生素。巯基化合物对金属 β-内酰胺酶的抑制作用强于EDTA，但其毒性作用较强，因此用EDTA进行检测更安全。
用于金属酶定性的试验方法主要有以下几种：一，EDTA双纸片协同及增效试验；二，三维试验法；三，分子生物学方法。
BLNAR流感嗜血杆菌的检测。定义，BLNAR取字头，意为 β-内酰胺酶阴性氨苄西林耐药。流感嗜血杆菌对氨苄西林耐药主要机制是产生 β-内酰胺酶，以质粒介导的TEM-1型酶为主，少部分产ROB-1型酶。B LNAR流感嗜血杆菌的耐药机制主要是由于染色体介导的青霉素结合蛋白的改变和外膜蛋白通透性下降所致。
对于这类菌株的检测，常规实验室一般采用氨苄西林和阿莫西林加克拉维酸双纸片结合的方法，如果K-B药敏结果显示氨苄西林和阿莫西林加克拉维酸均耐药，提示该菌可能为BLNAR流感嗜血杆菌菌株。国外学者研究发现，相对于常规检测方法，低浓度含量的氨苄西林和阿莫西林加克拉维酸纸片检测此类菌株，效果可能会更好。B LNAR流感嗜血杆菌被认为对阿莫西林加克拉维酸、氨苄西林加舒巴坦、头孢克罗、头孢他美、头孢尼西、头孢丙烯、头孢呋辛、头孢孟多、氯碳头孢和哌拉西林加他唑巴坦耐药，即使某些BLNAR菌株对上述药物体外实验显示敏感。
