分子生物学实验方案_分子生物学实验技巧

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实验一 分子生物学实验安全注意事项及分子生物学实验室所需要的仪器设备的使用（2学时）实验二 分子材料的采集、保存和植物/动物基因组DNA 的分离（8学时）实验三 DNA/RNA 的琼脂糖凝胶检测（4学时）实验三 聚合酶链式反应（PCR）（3学时）

实验四 PCR产物的琼脂糖凝胶检测与聚丙烯酰胺凝胶电泳检测（6学时）实验五 分子生物学软件的使用（4学时）

实验六 生物信息学（3学时）生物信息获取与利用 实验考试

实验三：琼脂糖凝胶电泳检测DNA

【目的要求】

学习并掌握DNA琼脂糖凝胶电泳基本原理和操作，了解如何通过电泳判断DNA纯度、含量和分子量。

【实验原理】

凝胶电泳是分离、纯化和鉴定DNA的常用方法。因为DNA分子是两性解离分子，在pH高于其等电点（约3.5）的中性或碱性溶液中带负电荷，在电场中向正极方向泳动。DNA凝胶电泳的介质主要有两种：琼脂糖凝胶和聚丙烯酰胺凝胶。聚丙烯凝胶的孔径较小，适合于分离5-500bp的小片段DNA；而琼脂糖凝胶的孔径较大，可以分离100bp-60kb的较大片段DNA。不同浓度的琼脂糖凝胶适合于分离不同大小的DNA片段（表7-1）。

琼脂糖是从海藻中提取出来的一种线状高聚物，当熔化后再凝固时就会形成固体基质，具有多孔的网状结构，孔径大小取决于琼脂糖浓度。DNA在琼脂糖凝胶中泳动时，受到电荷效应和分子筛效应的双重影响。电荷效应由分子所带的电荷量多少来决定，而分子筛效应则与分子大小和构象有关。在一定的电场强度下，DNA分子的泳动速度主要取决于分子量大小和构象。线状双链DNA分子在琼脂糖凝胶介质中的迁移率与其分子量的对数值成反比。分子越大，迁移速度越慢，从而可以将不同大小的DNA分子分开。因此，通过与DNA标准分子量参照物（MW marker）的迁移率对照，可以鉴定DNA分子的大小。DNA分子的构象也可以明显影响其迁移率。在细胞内质粒DNA有3种构象：超螺旋的共价闭环DNA（covalently closed circular DNA，cccDNA），松弛型的开环DNA（open circular DNA，ocDNA）和线性DNA，在琼脂糖凝胶电泳中，其泳动速度依次为：cccDNA >线性DNA >ocDNA，因而未酶切的质粒DNA在电泳中多显示为3条带，泳动速度最快的超螺旋带越亮，说明质粒DNA提取质量越好。

表7-1：不同浓度琼脂糖凝胶对DNA的有效分离范围

琼脂糖浓度（%）线性DNA有效分离范围(kb)0.3 5-60 0.6 1-20 0.7 0.8-10 0.9 0.5-7 1.2 0.4-6 1.5 0.2-4 2.0 0.1-3 DNA的迁移率还与电场强度（即单位长度的电压降）有关，电场强度越大，泳动速度越快。当需要快速观察电泳结果时，可以适当加大电场强度。但是电泳分辨率会随着电场强度的增大而缩小，因为高分子高速流动时摩擦力增加，相对分子质量与移动速度就不一定成正比，因此一般电场强度应不超过5V/cm。特别是当需要较精确测定DNA片段大小、获得理想的分辨率和漂亮的带型时，应该适当降低电场强度，相应的适当延长电泳时间，并选用相对较低的凝胶浓度。

为了显示凝胶中DNA的泳动位置，需要加入染色剂染色。最常用的染色剂是溴化乙锭（ethidium bromide EB）。溴化乙锭可以嵌入核酸双链的配对碱基之间，在紫外线的激发下发出橘红色荧光。一般是在凝胶中直接加入终浓度为0.5μg/ml的溴化乙锭，这样可以在电泳过程中随时利用紫外灯观察核酸的迁移情况。但是EB与DNA的结合会影响DNA的迁移率，因此对于需要较精确测定DNA片段大小、或需根据荧光强度测定DNA含量时，EB染色应在电泳结束后再进行（将凝胶浸入0.5μg/ml的溴乙锭水溶液中10min即可）。注意：EB是强诱变剂，使用EB必须戴一次性手套，不要洒在桌面地面上，被污染的物品必须专门处理后（加少量漂白粉可使EB分解），再彻底清洗或丢弃。

指示剂溴酚蓝和二甲苯青的作用是指示样品在凝胶中的迁移过程，以确定终止电泳时间。在0.6 %、1%、2%琼脂糖凝胶电泳中，溴酚蓝分别约与1kb、600bp、150bp双链线状DNA片段的迁移率大致相同。在1%琼脂糖凝胶中，二甲苯青大致相当于2kb双链线状DNA的位置。【试剂器材】

1．5×TAE：

2．10mg/ml溴化乙锭（EB），避光4℃保存。/ GoldView 常温保存。3．6×上样缓冲液（配方见附录）4．（电泳）琼脂糖

5． DNA、PCR扩增产物

6．DNA标准分子量marker（λDNA/HindIII）7．水平式电泳槽、电泳仪 8．透射式紫外灯 9．胶带

10．微波炉或恒温水浴 11．微量移液器 【操作步骤】

1．称取琼脂糖1g，置三角烧瓶中，加入1×TAE 100 ml，置沸水浴或微波炉中加热，使充分溶解。注意：微波炉煮沸1次可能不能充分溶解，需取出混合后反复加热1-2次，注意此时可能出现爆沸现象，避免蒸汽烫伤。

2．待琼脂糖溶液冷却至60-65℃左右时加入溴化乙锭/5ulGold View，使终浓度为0.5μg/ml，混匀。

3．用胶带把制胶模具的两端边缘封好，置水平位置，选择孔径适宜的加样孔模板（梳子），并垂直安插好。注意梳齿必须与模具底面保持一定距离（约0.5-1mm），防止样品槽破裂，导致样品泄漏。

图3-1：凝胶灌胶过程示意图

4．将冷却至50-60℃左右的琼脂糖溶液缓慢倒入制胶模具中，使凝胶液缓慢展开，直至形成厚度适当（一般为0.3-0.5cm）的胶层。小心去除加样孔周围的气泡。室温静置30-60分钟。（如图3-1）

5．琼脂糖完全凝固后，小心取出梳子，去掉模具两端的胶带，将凝胶放入电泳槽中。6．电泳槽中注入适量0.5×TBE缓冲液，使液面高于凝胶约1mm左右。7．分别取5μl DNA或者2μl PCR产物和约0.5μg DNA分子量marker，加入1/5体积（2ul）的上样缓冲液，混匀。

8．小心缓慢将样品上样于凝胶加样孔中。记录样品加样孔顺序。

9．上样完成后，尽快开始电泳，以防止样品漂流。接通电源，注意正负极是否正确。调节电压在1-5V/cm左右，样品进胶前电压不要太高。电泳开始后不久就可以观察到溴酚蓝从加样孔迁移到凝胶中。

10．根据指示剂迁移的位置，或根据反射紫外灯显示的DNA迁移位置，判断是否需要终止电泳。切断电源后，取出凝胶。

11．将凝胶置于透射紫外灯上，打开紫外灯（注意尽量避免使用254nm短波紫外灯，并戴好防护眼镜或防护罩），观察染色后发出橘红色荧光的DNA条带，拍照记录。

注意观察样品DNA条带是否清晰，有无拖尾现象，条带数量、大小是否正确，判断样品DNA分子大小，与预期大小是否相符，并目测粗略估算样品DNA含量。【注意事项】

（1）凝胶不能有气泡。（2）电泳是从负极到正极。

（3）EB是致癌剂，操作要带手套。【实验安排】

本实验一天内可做完。【作业】

写出实验步骤及注意事项。

相关溶液配制

1,50倍TAE缓冲液的配制(pH8.5)配方：2MTris-HAc、100mM EDTA 配制量：1L 配制方法：

1）称取Tris碱242.3g，置于烧杯中

2）称取EDTA固体29.3g或Na2EDTA-2H2O固体37.2g 3）加入700mLddH2O，溶解完全 4）加入57mLHAc，充分搅拌 5）用HAc调pH至8.5 6）定容至1L，室温保存

2，溴化乙锭(EB)【强致癌物】 配制量：100mL 配制方法：

1）1gEB于专用容器中

2）加入100mLddH2O,搅拌数小时至溶解完全 3）转移至棕色瓶中，避光保存 3，6×上样缓冲液Loading Buffer 配方：30mMEDTA；36%（V/V）丙三醇；0.05%溴酚蓝；pH7.0 配制量：100mL 配置方法：

1）6mL EDTA（500mM，pH8.0）加入50ml ddH2O中 2）5mL 1%溴酚蓝 3）取36mL丙三醇

4)用2N的NaOH调pH=7.0 5）定容至100mL 4，6×甘油上样缓冲液Loading Buffer 配方、配制量：

成分及终浓度 0.15%溴酚蓝

0.15%二甲苯靑EF 5mmol/L EDTA 50%甘油 水

配制10ml溶液各成分用量 1.5ml 1%溴酚蓝

1.5ml 1%二甲苯靑EF

100ul 0.5mol/L EDTA(pH8.0)3ml 3.9ml

5.GoldView(GV)GoldView(GV)是一种可代替溴化乙锭（EB）的新型核酸染料，其灵敏度与EB相当，使用方法与之完全相同，在100ml琼脂糖胶溶液中加入5µl GoldView™即可。在紫外透射光下双链DNA呈现绿色荧光，也可用于染RNA。

由于未发现GoldView™有致癌作用，且灵敏度与EB相当，将有可能逐渐取代EB而得以广泛应用。

概 述

GoldView™是一种可代替溴化乙锭（EB）的新型核酸染料，采用琼脂糖电泳检测DNA时，GoldView™与核酸结合后能产生很强的荧光信号，其灵敏度与EB相当，使用方法与之完全相同。在紫外透射光下双链DNA呈现绿色荧光，而且也可用于染RNA。

通过Ames试验、小鼠骨髓嗜多染红细胞微核试验、小鼠睾丸精母细胞染色体畸变试验，致突变性结果均为阴性；而溴化乙锭（EB）是一种强致癌剂。因此用Goldview™代替EB不失为一种明智的选择。

使用方法

1.将100ml琼脂糖凝胶溶液（浓度一般为0.8%~2%）在微波炉中融化。

2.加入5ul GoldView，轻轻摇匀，避免产生气泡。

3.冷却至不烫手时倒胶，待琼脂糖凝胶完全凝固后上样电泳。

4.电泳完毕在紫外灯下观察。若使用数码相机照相记录，则关闭相机的闪光灯，放在自动档即可；若使用凝胶成像系统照相，通过调节光圈、曝光时间，选择合适的滤光片，可得到成像清晰、背景较低的照片。

注意事项

1.胶厚度不宜超过0.5cm，胶太厚会影响检测的灵敏度。

2.加入GoldView的琼脂糖凝胶反复融化可能会对核酸检测的灵敏度产生一定影响，但不明显。

3.通过凝胶电泳回收DNA片段时，建议使用GoldView染色，在自然光下切割DNA条带，避免紫外线与EB对目的DNA产生的损伤，可明显提高克隆、转化、转录等分子生物学下游操作的效率。

4.虽然未发现GoldView有致癌作用，但对皮肤、眼睛会有一定的刺激，操作时应戴上手套。