石蜡包埋人体组织STR检验的探讨_各组织石蜡包埋

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【摘要l目的探讨普通甲醛对人体组织dna的影响及提高str检出率的手段。方法取少量石蜡包埋组织，65℃水浴脱蜡，chelex一100法提取dna，pcr扩增，循环次数分别为28次和28+6次，扩增产物经310型测序检测。结果普通甲醛固定5 d以内的组织基本上可检出amel及15个str基因座。固定时间延长，检

出率下降；pcr循环次数增加，灵敏度增加，但有错误分型的情况。

结论普通甲醛固定时问长短直接影响pcr—str的检验。减少模板量有利于pcr反应成功，pcr次数为28+6时，灵敏度增加，但

应谨慎判读结果，以免错误分型。

【关键词】石蜡包埋组织；dna提取；str

【中图分类号】d919．

2【文献标识码】b

【文章编号】1007—9297(2006)01—0050—0

3在某些民事案件中。成功对石蜡包埋组织进行

pcr—str分型来判断其归属问题。对案件的解决起到

重要作用。目前国内医院及科研机构大多使用普通

10％甲醛固定人体组织。普通10％甲醛固定石蜡包埋的组织中dna降解相对严重，提取高质量的dna并

进行pcr—str分型较为困难。实践中人体组织固定

时间长短不一，但以1周左右多见。本文的目的是探

索普通10％甲醛固定时间对pcr—str分型的影响以

及提高检出率的适当方法。

材料与方法

一、材料

石蜡包埋人体组织均取自本所病理室。5个无关

个体的心、肾组织用1o％普通甲醛固定5 d、8 d、12 d

和15 d以上时．剪取组织边缘甲醛完全浸润处。石蜡

包埋，常规切片he染色，显微镜下观察确保组织结构

清晰，无自溶、坏死和大片出血后，作为本研究材料使

用。

二、方法

1．预处理。切取8 ixm厚的石蜡包埋组织，尽量剔

除石蜡部分，放入0．5 ml离心管中；或挖取小米粒大的石蜡包埋组织，放入0．5 ml离心管中。加入500

ddw，65c【=保温10min脱蜡，弃除液体。【 】

2．dna的提取。向每个离心管中加入150 ixl的5％chelex一100和8 l pk(20mg／m1)，56 c【=保温过夜，次日再加4 lpk(20mg／m1)，再消化4h，振荡后，100cc

8rain，13000 rpm／min离心3rain，4 oc备用。

3．pcr扩增。采用identifiler荧光复合扩增。采用l反应体系，热循环条件：95 c【=预变性l1 rain；9

4oc 1rain，59 oc lmin，72℃ lmin，循环次数分别为28

次，28+6次(循环28次后，每反应管加0．3 ixl ampli

taq gold dna聚合酶，再循环6次)；[2】最后60℃延伸

45raino

4．上样检测。取1．5 l dna pcr产物与l2 l甲

酰胺(formamide)、0．4 ixl内标(liz)混合后，经过abi

310 dna自动测序仪电泳荧光检测，使用genescan(3．

1．2)和genotyper软件分析得出基因分型结果。

结果

1．经普通甲醛固定5 d、石蜡包埋的心和肾组织基

本上能检出完整的str等位基因型。而随着固定时间的延长，能检出的str基因座数目逐渐减少．出现了

大片段等位基因缺失、等位基因扩增不平衡的现象

(见图1。2)。本次试验中观测到最短固定时间为8 d的组织，因大片段等位基因缺失而造成假纯合子的错

误分型(见图3)。而固定时间超过15 d时。则最多只

能检出性别及个别小片段str基因型，常伴有分型错

误。

2．当pcr循环数从28次增加到28+6次(先循环

28次再加酶循环6次)时，可以检出以前信号弱、无法

判读的峰，提高了检出率(见图4)。循环次数的增加，dna检测灵敏度有所提高。但随着固定时间的延长，dna降解严重，增加扩增循环次数．易引起部分str

基因座的分型错误．如图5中d3s1358基因座出现的pull—up峰。

讨论

【作者简介】~gg(1971-)，女，硕士研究生，江西九江人，主要从事法医dna工作。tel：+86—10—68621174；e—mail：yuanliwcy@yahoo．com．cn

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