cccDNA宣传资料1113_夏季健康知识宣传资料
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cccDNA项目相关材料
背景资料：
在乙肝病毒感染的肝细胞核内可检测到一种不同形式的病毒DNA共价闭合环状DNA(covalently closedcircular DNA，cccDNA)，不与蛋白共价结合。HBV cccDNA是最先能检测到的复制中间体，是HBV 部分基因的mRNA和前基因组RNA 的合成模板。一个感染病毒体在感染肝细胞后只产生一个cccDNA 分子，但在处于稳定感染的每个肝脏细胞内大约有50～100个cccDNA拷贝。抗病毒药物虽然能减少rcDNA，但对细胞内cccDNA几乎没有影响。已有研究证实在维持基因稳定与再次复发之间的平衡时，cccDNA池有非常关键的作用，即使血清学已经转为抗HBs阳性，耐药突变仍能够发生在cccDNA上，并一直存在下去。
项目优势：目前市场上还没有完全成熟的临床检测在开展。荧光定量PCR检测灵敏度较高。
样本要求：
1.全血：用无菌注射器抽取受检者静脉血2-3ml，注入无菌5ml枸橼酸钠抗凝管中反复颠倒3-5次充分混匀，保持待检。
2.肝组织：无菌条件下取肝组织月100-500mg左右，转入洁净的1.5ml离心管中，保存待检。
样本保存和运输： 上述处理的组织样本可保存于-20度，保存期限6个月，-70度可长期保存，运送应采用0度。
检测方法：荧光定量PCR（探针法）
简单流程：全血样本：淋巴细胞提取---核酸提取---加样上机---结果分析
肝组织样本：肝组织破碎---核酸提取---加样上机---结果分析
试剂：北京索奥生物医药科技有限公司 《 乙型肝炎病毒cccDNA（HBV）核酸扩增检测试剂盒》 试剂盒检测下限5x102copies/ml。
仪器：AB 7500荧光定量PCR仪
报告时间：实验室需要 3个工作日比较合理
建议价格：200元/检测。
临床意义：cccDNA对乙肝病毒的复制以及感染状态的建立具有十分重要的意义，有助于合理用药，只有清除了细胞核内的cccDNA，才能彻底消除乙肝患者病毒携带状态，是抗病毒治疗的目标。作为探讨是否存在肝外复制的重要指标；评价乙肝患者肝脏损伤程度的可能指标之一；cccDNA 在HBV 慢性感染的自然过程中, 可能持久存在, 也表明cccDNA 在癌组织和癌旁组织的分布不同；可能作为抗病毒药物疗效评价及停药的指标之一。（详见下页文献总结）
适用人群：乙肝患者，血清HBVDNA含量较低或者检测不到者。感染科，肝病科，消化科等
文献总结：
cccDNA，即共价闭合环状DNA（covalently closed circular DNA)。乙肝病毒感染宿主细胞后在细胞内复制并建立感染状态，病毒松弛环状DNA（rcDNA）进入细胞核，利用宿主DNA聚合酶和拓扑酶等“修复”形成的、结构完整的、超螺旋双链DNA分子。cccDNA是乙型肝炎病毒(H epatitis B v irus,HBV)DNA 在宿主细胞核内的存在形式, 是H BV 的原始复制模板, 长期存在于细胞核中, 目前的药物难以将其清除, 成为H BV 持续感染和抗病毒药物停用后病情反复的关键因素。机体通过免疫清除HBV cccDNA 的途径主要有: 1)通过细胞溶解机制, 清除感染的肝细胞, HBV 被巨噬细胞吞噬或与抗-HBs 抗体结合成为免疫复合物后被巨噬细胞吞噬并从尿中排出。破坏的肝细胞由新生肝细胞替代;2)通过Th1 反应介导的依赖细胞因子的非细胞溶解机制, 如干扰素、肿瘤坏死因子和白介素-2 等细胞因子清除HBV。检测H BV cccDNA 对进一步认识H BV 生活周期及指导抗病毒治疗等有重要意义。HBV cccDNA 有可能成为临床评价抗病毒疗效的重要指标, 在确定抗病毒治疗的最佳治疗方案、时间、治疗终点以建立最优的抗HBV 策略, 分析机体和药物清除cccDNA 的机制, 以及促进新药的研发等方面具有重要意义。同时, HBV cccDNA 的检测对研究HBV 的生物学特性、致病机制、乙型肝炎慢性化机制等方面也将具有积极的意义。有研究者提出检测患者肝脏中cccDNA 水平有助于决定停用抗病毒治疗药物的时机,而检测患者外周血中cccDNA 水平有助于了解病毒复制的活跃程度。
HBV具有嗜肝性，由于cccDNA 主要存在于肝细胞核中,所以认为用肝组织检测cccDNA 是较为可靠和准确的方法。研究发现肝细胞中cccDNA 和HBV DNA 的含量比血清中的HBV DNA 能更好地反映乙肝患者体内病毒的清除情况，但肝组织检测cccDNA 需要作肝穿,存在着费时费力且患者难以接受的问题，而且cccDNA 在肝脏中的分配不均匀，意味着检测肝活检的部分组织并不能代表整个肝脏cccDNA的分布，且不同的肝穿组织检测结果存在较大的差异。
由于肝穿组织检测cccDNA存在着一定困难，而且从理论上讲肝细胞核内的cccDNA分子在肝细胞变性、坏死时可以释放到血液中，提示血清HBV cccDNA 的检测对监测血液中的c c
D N A 的动态变化有现实意义，目前通过肝活体组织检查来监测乙型肝炎患者肝组织中的 ccc D N A 水平变化存在着一定困难, 因而监测血液中的c c D N A 的动态变化也许更具有现实意义。当然, 其中还存在一些问题有待研究和解决, 比如血液中的c c D N A 水平远远低于肝组织中的c c cD N A。
国外众多学者发现：外周血淋巴细胞同样存在HBV感染复制的现象，外周血中出现cccDNA 可能是肝脏出现损伤(如炎症、坏死等)的早期表现。因此检测外周血HBV cccDNA同样能反映HBV复制状况及评价药物疗效，可作为慢性乙肝病人HBV 活化和肝脏损伤的早期信号，而且比肝组织更方便、更容易准确定量；只是限于外周血cccDNA浓度较低，而且cccDNA在血液中的稳定性存在异议，其检测有较大难度。
但是K oc k 等[s] 用H B v 去感染体外培养的PB M C 时, 发现不能在细胞内检测到c c c
D N A , 相反, 如果转染的是肝细胞, 则非常容易检测c c c DNA。此外, 在乙型肝炎患者的肝组织内, 能检测到c c D N A和rc D N A , 而在其P B M C 中, 则只能检测到rc D N A。因此作者认为H B V 是不能感染P B MC 的, 即使P B M C 中检测到H B V ,也只是肝脏中的病毒释放到血液中后可能与PB M C 表面牢固结合, 不易被磷酸盐缓冲液等洗涤下来, 抽提细胞所得到的病毒D N A 其实并不存在于细胞内;或病毒仅仅是被P BM C 所“ 吸收” , 并没有建立真正意义上的感染状态。
目前通过肝活体组织检查来监测乙型肝炎患者肝组织中的cc c D N A 水平变化存在着一定困难, 因而监测血液中的c cc D N A 的动态变化也许更具有现实意义。当然, 其中还存在一些问题有待研究和解决, 比如血液中的cc c D N A 水平远远低于肝组织中的cc c D N A水平,也远远低于血液中的rc D N A 水平, 因此在c cc D N A 定量检测的灵敏度必须进一步提高。此外, c c c D N A 不同于rc D N A , 后者存在于H B V 核心中, 外有核衣壳蛋白保护, 因而在血液中是比较稳定的;而c c D N A 原本存在于肝细胞核中,不与蛋白共价结合, 肝细胞被破坏释放到血液中时从理论上讲应该是裸露的核酸分子, 因此在血液中是否稳定尚存疑问。
由于HBV感染的靶器官主要是肝脏，但是很多肝外器官，如骨髓、脾、肾、胰腺、结肠、胃、睾丸、精子及外周血单个核细胞(PBMC)等均能被HBV感染。Wong DK等用入侵检查技术对慢性乙肝患者的cccDNA 进行了研究，结果发现，75 %患者的血清中检测到cccDNA ,并且
5发现,当患者血清中HBV DNA
细胞中HBV DNA
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