荧光定量PCR的应用_荧光定量pcr的应用

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荧光定量PCR 的原理及应用

荧光定量PCR 是一种新的实时定量检测特定核酸技术,它是核酸探针技术、荧光共振能量传递技术和PCR 技术的有机结合，具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等特点,是对原有PCR 技术的革新,扩大了PCR 的应用范围。

实时荧光定量PCR（FQ-PCR）作为荧光定量PCR技术的一种，是基于荧光能量传递技术,通过受体发色团之间偶极-偶极相互作用,能量从供体发色基团转移到受体发色基团,受体荧光染料发射出的荧光信号强度与DNA产量成正比,检测PCR 过程的荧光信号便可得知靶序列的初始浓度。它融汇PCR 技术的核酸高效扩增、探针技术的高特异性、光谱技术的高敏感性和高精确定量的优点,直接探测PCR 过程中荧光信号的变化以获得定量的结果。目前已在众多领域有广泛的应用。

1、FQ-PCR 在预防兽医学中的应用

PCR 技术的应用有许多局限,不能准确定量,假阳性率太高,只要有微量病原体存在就可以得到阳性结果,这不能完全作为诊断依据,只有当一定数量的病原体存在时才有临床意义。FQ-PCR实现了PCR 从定性到定量的飞跃,有效解决PCR 污染和对模板定量不准确等问题。

1.1在动物病原菌检测和鉴定中的应用

炭疽杆菌作为人兽共患病的病原,尤其炭疽杆菌的芽胞可作为生物武器的病原。科学家在100 L 纯化空气中加入炭疽杆菌芽孢,进行FQ-PCR检测,1 h 内炭疽杆菌的单个芽孢就被检测到。

1.2在动物病毒检测和鉴定上的应用

FQ-PCR已应用于许多病原体的检测,如对艾滋病病毒、乙型肝炎病毒DNA、尖锐湿疣皮损中HPVD-NA、与鼻咽癌关系密切的EB 病毒、结核分支杆菌、巨细胞病毒、A 型和B 型流感病毒等病原体的检测。

3.3在动物寄生虫检测和鉴定中的应用

常用TaqMan 探针。如在被感染猪和鼠组织、全血、羊水以及脑脊髓液中的弓形虫定量,其检测极限相当于套式PCR , 但准确率大大提高。

2、FQ-PCR在畜牧业中的应用

科学家采用TaqMan 探针检测鸡γ干扰素、采用RT-FQ-PCR 证明中国黄牛背最长肌中cap nl mRNA 表达量与宰后3 d 的牛肉嫩度高度相关等。

3、FQ-PCR在其他方面的应用

3.1在动物检疫领域的应用

FQ-PCR 可对动物源性饲料、食品或其他日用品中牛羊源性成分的定量检测。

3.2细胞因子表达定量检测

常用FQ-PCR 测定细胞因子mRNA 表达情况,分析机体免疫状态。利用FQ-PCR 测定鸡、猪在注射疫苗、免疫增强剂以及在感染某种疾病情况下体内细胞因子的mRNA 表达水平。

3.3环境监测

应用FQ-PCR 对水资源及居家、办公环境中的大肠埃希菌、藻青菌和一些寄生虫进行监测。

3.4转基因生物中的应用

用一个已知拷贝数的内源基因作为参照,同时对样品作内源基因和外源基因的FQ-PCR。两者达到荧光阈值时的Ct 值可得到外源基因的拷贝数;FQ-PCR 还可用于转基因动物的纯合性鉴定及对转基因后外源基因表达情况进行监测。