牙鲆肌肉发育调节基因的克隆、表达及功能分析_基因的克隆表达分析

牙鲆肌肉发育调节基因的克隆、表达及功能分析由刀豆文库小编整理，希望给你工作、学习、生活带来方便，猜你可能喜欢“基因的克隆表达分析”。

《中国科学院研究生院（海洋研究所）》 2008年

加入收藏 获取最新

牙鲆肌肉发育调节基因的克隆、表达及功能分析

张玉青

【摘要】： 本文克隆了牙鲆的成肌因子MyoD和Myf5,以及牙鲆的Forkhead基因FoxD1、FoxD3和FoxD5,并对其在牙鲆肌肉发育中的功能进行了分析。牙鲆MyoD和Myf5基因都具有三个外显子,两个内含子。其编码的氨基酸序列都含有保守的bHLH;牙鲆FoxD1,FoxD3,FoxD5基因都只有一个外显子,编码的氨基酸序列都含有保守的翼状螺旋DNA结合结构域。在胚胎发育早期,Myf5在近轴中胚层中表达,体节发生过程中,Myf5在体节中表达,MyoD基因最早在分节板的体节前细胞中表达,随后在近轴细胞、体节中表达;随着胚胎的发育,Myf5在成熟体节中表达量降低,在新生体节中表达较强;MyoD自30个体节时期后只在新生的尾部体节中表达,在成熟的体节中表达量降低;在孵化期,MyoD和Myf5在头部及鳍的肌肉、尾部的体节中表达;生长期的牙鲆中,Myf5在骨骼肌和肠中表达,成体牙鲆中,Myf5只在肌肉中表达;生长期的牙鲆及成体牙鲆中,MyoD只在肌肉组织中表达。牙鲆MyoD和Myf5的启动子可以驱动绿色荧光蛋白在斑马鱼肌肉纤维中表达,其包含了这两个基因正常表达所需的核心区域,并可以跨物种行使功能。在胚胎发育早期,FoxD3在未迁移神经嵴前体细胞、体节、耳后的基板、头部和躯干的神经嵴细胞、松果体中表达。牙鲆FoxD1主要在脑,体节,肾脏及肠中表达。牙鲆FoxD5主要在体节、尾芽、前脑、耳泡中表达。在斑马鱼中过量表达牙鲆FoxD3,并与斑马鱼的同源基因进行比较,结果表明注射牙鲆和斑马鱼FoxD3的斑马鱼胚胎表型一致,它们在中轴两侧的发育出现了不同步现象,MyoD和Myf5在近轴中胚层中的表达受到不同程度抑制。因此,FoxD3在不同物种之间保守,并且FoxD3在肌肉发育的调控通路中可能通过与MyoD和Myf5相互作用而行使功能。在斑马鱼中过量表达FoxD1后,MyoD在一侧体节中的表达受到了严重抑制,而在近轴细胞中的表达未受影响,Myf5在体节前中胚层,近轴细胞,及体节中的表达都受到了抑制。FoxD1在胚胎发育的早期可能通过调控MyoD和Myf5的表达而参与肌肉发育的调控。将牙鲆FoxD5在斑马鱼中过量表达,MyoD在一侧体节中的表达量有所升高,而在近轴细胞中的表达未受影响;Myf5在一侧体节和体节前中胚层中的表达也有所升高,表明牙鲆FoxD5可以调控肌肉调节因子MyoD和Myf5的表达而参与早期肌肉发育的调控。

【关键词】：牙鲆 Paralichthys olivaceus Myf5 MyoD FoxD1 FoxD3 FoxD5 RT-PCR 原位杂交 显微注射 过量表达

【学位授予单位】：中国科学院研究生院（海洋研究所）【学位级别】：博士 【学位授予年份】：2008 【分类号】：Q78;S917.4 【目录】：

 摘要6-8                                       Abstract8-10 第一章 引言10-36 1.胚胎肌肉发育10-14 1.1 动物的肌肉发育10-12 1.2 鱼类的肌肉发育12-14 2.骨骼肌发育的特化信号14-20 2.1 Hedgehog 信号系统14-16 2.2 Wnt 信号系统16-17 2.3 TGF-β 信号17-18 2.4 成纤维细胞生长因子18-19 2.5 Pax 基因家族19-20 3.肌肉调节因子(MRFs)20-26 3.1 肌肉调节因子的结构与功能20-24 3.2 肌肉调节因子的调控24-26 4.FoxD 家族基因及其在胚胎发育中的作用26-34 4.1 Forkhead 家族基因概述26-30 4.2 FoxD 家族基因30-34 5.用显微注射方法在斑马鱼中进行基因功能研究34-35 6.研究意义35-36 第二章 牙鲆 MyoD 和 Myf5 的克隆、表达及功能分析36-74 1.材料与方法36-44 1.1 牙鲆和斑马鱼的培育与实验材料的获得36-37 1.2 实验试剂37 1.3 质粒与菌株37 1.4 仪器37 1.5 计算机程序37 1.6 引物37-38 1.7 实验方法38-44 2.牙鲆肌肉调节因子 MyoD 的克隆与功能分析44-57 2.1 牙鲆 MyoD 基因组,cDNA 的克隆及序列分析44-51 2.2 牙鲆 MyoD 在胚胎中的时空表达51-53 2.3 牙鲆 MyoD 在生长的牙鲆中的时空表达53-54 2.4 牙鲆 MyoD 在胚胎发育早期及成体中表达的半定量分析54-56 2.5 小结56-57 3.牙鲆肌肉调节因子 Myf5 的克隆与功能分析57-70 3.1 牙鲆 Myf5 基因的克隆与序列分析57-62 3.2 牙鲆 Myf5 启动子和第一个内含子的保守序列分析62-65 3.3 牙鲆 Myf5 在胚胎中的时空表达65-68                                 3.4 牙鲆 Myf5 在生长的牙鲆不同组织中的表达68 3.5 牙鲆 Myf5 在胚胎发育早期及成体中表达的半定量分析68-70 3.6 小结70 4.牙鲆 MyoD 和 Myf5 启动子驱动的绿色荧光蛋白在斑马鱼胚胎中的表达70-74 4.1 重组质粒 MyoDP-GFP,Myf5P-GFP 的构建71 4.2 牙鲆 MyoD 和 Myf5 启动子驱动的绿色荧光蛋白在肌肉中特异的表达71-73 4.3 小结73-74 第三章 牙鲆 FoxD3 的克隆、表达及功能分析74-94 1.材料与方法75-77 2.牙鲆 FoxD3 基因的克隆与序列分析77-83 3.牙鲆 FoxD3 在胚胎发育早期的表达83-85 4.斑马鱼中过量表达牙鲆 FoxD3 对早期胚胎发育的影响85-89 5.讨论89-92 6.小结92-94 第四章 牙鲆 FoxD1 的克隆、表达及功能分析94-108 1.材料与方法94 2.牙鲆 FoxD1 基因的克隆与序列分析94-99 3.牙鲆 FoxD1 在胚胎中的时空表达99-102 4.斑马鱼中过量表达牙鲆 FoxD1 对早期胚胎发育的影响102-104 5.讨论104-106 6.小结106-108 第五章 牙鲆 FoxD5 的克隆、表达及功能分析108-121 1.材料与方法108 2.牙鲆 FoxD5 基因的克隆与序列分析108-111 3.牙鲆 FoxD5 在胚胎中的时空表达111-116 4.斑马鱼中过量表达牙鲆 FoxD5 对早期胚胎发育的影响116-117 5.讨论117-120 6.小结120-121 结论121-124 参考文献124-145 发表文章145-146 致谢146