水稻持绿基因的分子克隆及其功能分析的研究_水稻已克隆基因表

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水稻持绿基因的分子克隆及其功能分析的研究

Molecular cloning and function analysis of the stay greengene in rice前言

水稻持绿色突变体(stay green rice,sgr)，由新疆农业科学院梁乃亭等人通过对日本水稻“花之舞”品种的干种子经过γ射线处理后,在M2代群体中选育出的，主要表现为在自然衰老和暗诱导衰老过程中能够保持很高的叶绿素含量，叶片保持可见的绿色。

对持绿基因进行定位并克隆，此后可将该基因导入蔬菜、烟草、花草、树木等植物，培育永绿色蔬菜、观赏性花草树木新品种。

但要与绿色超级稻的概念相区别。绿色超级稻：由中国科学院院士、华中农业大学生命科学技术学院院长张启发教授提出的水稻新概念，即水稻基本不打农药、少施化肥、节水抗旱的水稻。

持绿突变体的类型：功能型突变体（A型：衰老开始较晚，以正常速率结束；B型：衰老开始正常但结束相对缓慢）；非功能型突变体（C型：由于霜冻或干旱，持绿最终导致叶片死亡。D型：由于对叶绿素降解机制不起作用，叶绿素可以无限期的存在，衰老过程与野生型相同；E型：保持很高的叶绿素含量，光合作用不增加。）水稻持绿基因的分子克隆 2.1 分离持绿色突变体

图1籽粒灌浆期后 图2 黑暗条件下

持绿色表现型在F1群体中不表达，在回交F2群体中野生型与持绿型出现3：1的分离比，表明持绿色突变是由单个隐性核基因控制。

突变体净光合速率（Pn）相对于野生型没有明显的提高,光化学效率(Fv/Fm)没有明显的改变。

SGR突变阻碍了叶绿素降解,使叶片呈现出持绿色表型,但在植物衰老过程中不能维持其光合效率。因此它属于非功能C型突变体。

2.2 克隆持绿基因

在1880株F2突变群体中通过图位克隆和DNA序列分析（STS)精确定位，突变基因是位于水稻第九个基因的长臂上,是一个单核苷酸突变（A251突变为G251）（如下图）。

2.3 SGR过表达载体转基因植株

为了研究SGR转录是怎样影响叶片衰老，利用花椰菜花叶病毒35S为启动子把SGR转入到野生型水稻中，形成两个独立的转基因家系。

整个转基因体系的建立步骤大致可以归纳为：目的载体的构建---载体的农杆菌转化---农杆菌与植株共培养---转化植株的筛选---转化植株的鉴定。

GUS基因（又称报告基因）的组织化学法检测即具有Gus活性的部位或位点呈现蓝色，且在一定程度下根据染色深浅可反映出Gus活性。SGR的过表达可以通过此法看出表达情况。（筛选重组子）如下左图

由半定量RT-PCR（逆转录酶PCR）分析可测定叶片中目的基因SGR的表达量增加或减少。(表达的量)如上右图水稻持绿基因功能分析 3.1 SGR的表达和调控

通过Rt-PCR表达结果分析表明：SGR不仅可以在叶子中存在，也存在于萌发的种子和根中。如下图

在营养液中分别培养离体叶片，结果如图所示，野生型水稻中，ABA加速了叶绿体分解，促进叶片黄化；而6-BA抑制叶绿体分解，延缓叶片黄化。而在突变体中ABA、6-BA影响不是很明显。如下图

由下图可以看出：在野生型和突变体暗诱导衰老过程中SGR和PaO都处于上调状态。在ABA的作用下，增加了它们的上调程度，而6-BA减少了上调的程度。

通过Western Blot(蛋白质印迹)分析表明：水稻叶片中SGR蛋白水平随着SGR表达的增加而增加。经ABA处理后SGR蛋白表现出明显的增加，而6-BA处理后SGR蛋白比正常生长叶片中SGR蛋白更少。

3.2 叶绿体色素的变化

在正常的光照下水稻野生型和突变体的Chl,Carotenoids,Chla/b没有明显不同而SGR过表达载体转基因植株的叶片Chl相对于野生型低30%,而Chla/b高10%；

在黑暗条件下，野生型和突变体的叶绿素总含量分别下降了80%、90%，Chl a/ b也明显下降，而突变体保留了75%的Chl，Chl a/b也增加了。

3.3 蛋白质的变化

在黑暗条件下，野生型和突变体中可溶性蛋白(主要为Rubisco)和膜蛋白（主要为捕光蛋白）都在下降，但突变体较野生型更稳定。

但在突变体中可溶性蛋白明显下降也解释了突变体在衰老过程中不能保持光合作用的原因。

结论

4.1 SGR突变在自然衰老和暗诱导衰老过程中能够保持很高的叶绿素含量,叶片保持可见的绿色。但突变体净光合作用速率（Pn）、光化学效率(Fv/Fm)相对于野生型没有明显的提高。因此,水稻持绿色突变体属于非功能C型永绿色突变体。

4.2 SGR的表达受脱落酸（ABA）促进，但被6-BA(一种细胞分裂素)抑制。

4.3 SGR突变能够在叶片衰老过程中阻滞叶绿体内类囊体解体、叶绿素降解和部分蛋白质的降解。随着sgr转录的增加也提高了水稻叶绿体的破坏。4.4 在水稻中叶绿素降解需要一系列叶绿素降解酶的作用。在叶片衰老过程中,突变体具有较高的Chla/Chlb值，SGR可能参与PaO活性的调控。