western 内参选择 大讨论_westernblot内参选择

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在western blot 实验中，内参的使用是个很重要的部分，看到很多站友对内参的选择 经常有些疑问，鉴于此，希望能在一个帖子里面综合所有相关问题，展开讨论，共同学习。

我先提几个，抛砖引玉，希望大家继续。1。为什么一定需要内参？内参的重要性。2。常用的几种内参。

3。不同的情况如何选择不同的内参。支持一下！

1：用内参照是为了评价你的各个上样孔内蛋白的总量是否基本一致，通常使用一些看家蛋白，比如β-actin、GAPDH等等。这些蛋白在所有细胞中的表达量基本一致，所以用他们来作为你加样量的对照。这样western结果中你的目的蛋白经过处理后发生变化，而内参的条带基本均匀一致。这样才有说服力，表明的确是处理因素造成目的蛋白的变化而不是加样误差或是人为造成目的条带浓度的变化。严格意义上说，内参事必须做的。

2：常用的内参有：b-actin，GAPDH，近2-3 年，更详细的研究发现，β-Tubulin(球管蛋白)，被广泛应用于Western Blotting，β－Tubolin分子量为55KD左右。

3：一般我们选择内参与要检测的目的蛋白的分子量最好相差5KD以上。因此你要知道你检测的蛋白的分子量来选择合适的内参！个人一些见解，供参考！

内参的重要性，必要性：

要检测一个基因的表达产物是否正确，或者比较表达产物量的相对变化，首选方法是Western Blot。因为Western Blot操作相对简单方便，既可以定性分析表达产物，同时还可以指示目的蛋白量的相对变化。虽然，顺利的时候Western Blot做起来很简单，可不顺的时候也很令人心烦――做不出结果啦、假阳性啦、结果出现多条带啦、到底是一抗有问题还是二抗有问题啦……毕竟，作为一种有活性的生物大分子，抗体和抗原的反应毕竟不象1+1那么明确，而用这种不确定的试剂来测定同样知之甚少的表达产物，确实是有一定的不确定性的。所以，严谨的Western Blot实验设计中要求有良好的参照体系，对实验结果分析是非常有用。特别是当实验出现问题时，借助参照体系很容易就可以查出问题所在，而不必抓耳挠腮怨天尤人。良好的参照体系通常包括分子量Marker（用来确定蛋白条带对应的分子量大小），空白载体对照（如果是诱导表达体系还应该有诱导前的对照），已知量标准产物的正对照；另外还有内参。可是由于经费限制或者偷懒的原因，国内的不少人做Western Blot往往省略参照，导致结果出现问题时无法分析结果――即便有结果也可能影响结果的分析。

内参是最容易被忽略的一项。我们知道，要用Western Blot比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少，前提条件是等量的细胞上样，才有比较的基础。特别表达量不高时，上样量的差别就很可能影响结果的分析。所以你需要内参。

内参即是内部参照（Internal Control），对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。在Western Blotting 实验中，除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外，还需要进行内参的检测，以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。

在国外发表的文章中，Western Blotting 实验结果须进行内参校正已成为一种惯例。但是，国内仍有不少科研人员在Western Blotting实验中忽略了内参的使用，将蛋白浓度测定作为规范需相互比较的各种样品间上样量等同的唯一方法。然而各种蛋白质浓度定量方法，都存在局限性，不能完全准确的确定各种样品的准确蛋白浓度。如UV法直接定量，适合测试较纯净、成分相对单一的蛋白质，相对于比色法来说，操作简单，但是容易受到平行物质的干扰，如DNA的干扰；且敏感度低，要求蛋白的浓度较高。比色法测定蛋白浓度一般有BCA，Bradford，Lowry 等几种方法。BCA法与Lowry法都容易受到蛋白质之间以及去污剂的干扰。Bradford 法敏感度最高，且与一系列干扰Lowry，BCA 反应的还原剂（如DTT，巯基乙醇）相容。但是对于去污剂依然是敏感的，其最主要的缺点是不同的标准品会导致同一样品的结果差异较大，无可比性。另外，蛋白质定量以后进行电泳时需要等量上样，此步骤也存在操作误差。在Western blotting实验时使用内参，即可简便地对定量和上样步骤产生的误差进行校正。

在Western Blotting中使用内参其实就是在WB过程中的另外用内参对应的抗体检测内参，这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达，由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定，借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。此外使用内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全、整个Western Blot显色或者发光体系是否正常。

我想问一下,内参和目的蛋白相差15kD能不能将膜上他门的位置(用预染)分别剪下来,孵育啊?还是必须得跑两张膜一个内参一个目的蛋白啊?洗膜的时候可以放在一起洗么?如果他们是同源的二抗可以放在一起孵育么? 回答楼上的问题：完全可以剪开分别加一抗孵育，我就是这么做的；洗膜时最好分开洗涤，放在一起的话两张膜可能重叠在一起，影响洗膜效果；如果不剪膜，你两个一抗来源相同而且特异性很好（单抗）的话，可以一起孵育，不过应该注意可能存在的交叉反应，你可以尝试一下看看结果再定。本人是新手，问一个很汗的问题，原核表达也需要做内参么？做内参的蛋白在哪里找？ 不甚感激

在Western Blotting实验过程中使用内参的方法有：

一、超级简便的标记内参使用法：只要在二抗孵育时加入HRP标记内参抗体，按照正常操作即可。

二、普通内参：当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量相差不大时，可以先进行目的蛋白的抗体温育显色和检测。然后使用Strip缓冲液洗掉膜上的抗体，重新进行内参蛋白的抗体温育、显色检测。

三、当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量大小相差比较明显情况下，可以在转膜后预染，根据蛋白质Marker的大小将膜剪为大分子量和小分子量两部分，使内参蛋白与目的蛋白分开。然后两块膜分别与内参蛋白抗体以及目的蛋白抗体进行温育，二抗温育以及显色。

常用的蛋白质内参有GAPDH（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase）和细胞骨架蛋白beta-actin或beta-tubulin。我们实验室使用最多的是***工程有限公司与国外实验室合作开发的GAPDH，100μl一支，浓度为100μg/100μl，价格为988元人民币。虽然公司网上称稀释比达1：10000以上，至少可做100次Western mini-blots，但我们一般按照1：5000～6000稀释，不过效果确实非常好，荧光条带非常亮，而且抗体使用3～4次也没太大改变。

我们也使用过博奥森的beta-actin，200ul 480元，稀释比1：200～500。因为稀释比不高，所以价格并不便宜。更可气的是，我PC 12细胞居然有两条条带，小鼠也是两条。我也同意剪开,但是别忘记一个问题.你 要确保你剪开的部位没有蛋白.kang chen的HRP－标记内参很好

不需要剪膜 更为直观，有说服力 我做了半年的western,就我对内参的理解如下

1.所选内参有一下:GAPDH,beta-actin,beta-tubulin等是一些细胞的基本结构蛋白或是管家蛋白,细胞表达稳定,且表达水平高,在同一种类的细胞上表达基本一致.2.做内参可以:一,检验你的整套western装置是否正常run effectively.包括你的配液,你的胶以及电泳和转移,一抗的效价以及显色等.二检测你的样品蛋白含量是否相等.3.选择内参要根据你的目的蛋白的性质即你的 目的蛋白是胞内还是核内,你蛋白的 分子量是大是小,当然还有价钱以及你的目的.4.一般内参是比较容易作出来的,同时它也是帮助你摸索条件的,你把其做漂亮,你后面就很顺利了,只是转移的条件有点变化.其余照样或根据说明书操作.我想请问一下如果内参和目的蛋白的差距很大，比如我的目的蛋白是一百多ＫＤ，可是常用的内参都是３０～５０ＫＤ，是不是一定要分块胶来跑呢？

那么，我想请教一下用过β-actin做内参的朋友，有没有遇到过β-actin抗体检测不到小鼠心肌和肌肉组织β-actin的情况？当然前提是：1，我的确提取到了心肌和肌肉组织的总蛋白，且检测到了我的目的条带。2，用此抗体可以检测到其他组织中β-actin条带。

也发现，在碧云天网站上，曾提及“本抗体不能用于成年动物心肌或骨骼肌的免疫染色”。http://www.daodoc.comA，TATA-box bingding protein（TBP）甚至线粒体的内参来代替，当然我认为这种可能性出现的几率比我买彩票中大奖差不多。今晚回答这个问题对于我来说也是一个考验，很多基础知识都是通过网络和拚命的回忆来的，也算是对于actin这个内参的一个全面了解了，希望有所帮助。

补充一点选内参的原则：所选的内参与目的基因之间不能有调节关系，否则内参就不客观了，如：你是做与糖代谢相关的基因就不能选GAPDH，与细胞骨架相关的就不能选β-actin。

在Western Blotting中使用内参其实就是在WB过程中的另外用内参对应的抗体检测内参，这样在检测目的产物的同时可以检测内参的表达，由于内参在各组织和细胞中的表达相对恒定，借助检测每个样品内参的量就可以用于校正上样误差，这样半定量的结果才更为可信。此外使用内参可以作为空白对照，检测蛋白转膜情况是否完全、整个Western Blot显色或者发光体系是否正常。

实验结果分析其实很简单：如果样品蛋白量有限，只够进行一次电泳转膜实验时，分别检测样品的内参量和目的蛋白量。将各样品目的蛋白量分别除以其内参含量，得到的数值即为内参校正后的各样品中目的蛋白相对含量，再用此数值进行样品间的比较和分析，得到目的蛋白含量在不同样品间的实际变化结果。如果样品量充分，可以先检测内参，观测样品间内参显色条带是否一致，根据差异大小调整各样品的上样量重新进行Western Blotting实验，至内参量一致为止；若内参一致，即可进行不同样品间目的蛋白表达变化分析。这样虽然麻烦一点，但是可以保证结果更有说服力，更可信。毕竟我们的实验是一种严谨的工作 在Western Blotting实验过程中使用内参的方法有：

一、超级简便的标记内参使用法：只要在二抗孵育时加入HRP标记内参抗体，按照正常操作即可。

二、普通内参：当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量相差不大时，可以先进行目的蛋白的抗体温育显色和检测。然后使用Strip缓冲液洗掉膜上的抗体，重新进行内参蛋白的抗体温育、显色检测。

三、当目的蛋白的分子量大小与选用的内参蛋白分子量大小相差比较明显情况下，可以在转膜后预染，根据蛋白质Marker的大小将膜剪为大分子量和小分子量两部分，使内参蛋白与目的蛋白分开。然后两块膜分别与内参蛋白抗体以及目的蛋白抗体进行温育，二抗温育以及显色。

内参即是内部参照（Internal Control），对于哺乳动物细胞表达来说一般是指由管家基因编码表达的蛋白(Housekeeping Proteins)，它们在各组织和细胞中的表达相对恒定，在检测蛋白的表达水平变化时常用它来做参照物。在Western Blotting 实验中，除了需要进行蛋白抽提、蛋白定量、等量蛋白上样电泳、转膜、靶蛋白抗体孵育、显色等步骤以外，还需要进行内参的检测，以校正蛋白质定量、上样过程中存在的实验误差，保证实验结果的准确性。

实际上内参是最容易被忽略的一项。我们知道，要用Western Blot比较不同条件下或者不同组织中，目的蛋白表达量的相对多少，前提条件是等量的细胞上样，才有比较的基础，特别表达量不高时，上样量的差别就很可能影响结果的分析，所以需要内参。在国外发表的文章中，Western Blotting 实验结果须进行内参校正已成为一种惯例。但是，国内仍有不少科研人员在Western Blotting实验中忽略了内参的使用，将蛋白浓度测定作为规范需相互比较的各种样品间上样量等同的唯一方法。

不同异构体表达对蛋白的检测是有很大的影响，买抗体前要好好熟悉自己的目的蛋白，很多抗体杂不出条带其实未必是抗体质量的问题。很多公司的内参抗体是用抗原片段制备的，不同的公司选择的片段不一样。以最常用的beta-actin为例，有的公司选择N-端，有的选择C－端。选用N-端Ac-Asp-Asp-Asp-Ile-Ala-Ala-Leu-Val-Ile-Asp-Asn-Gly-Ser-Gly-Lys 16aa作为抗原制备抗体(单抗和多抗)的占大多数，主要有santa cruz(Cat# sc-69879),sigma(Cat# A1978等)，ProSci(Cat# 3779),Cell Signaling(Cat#4967)，Axxora PLATFORM(BET-A300)等，这类抗体均不能检测心肌和横纹肌中的actin条带。选用C-端16aa短肽作为抗原制备抗体的主要有Axxora PLATFORM(PSC-3777)，EPITOMICS(1784-1,1854-1等)，这类抗体可以在肌肉细胞中检测到actin阳性信号。有时候在实验中检测内参时产生“组织特异性”，就是由于抗体选择不对造成的。我来说点不同看法

内参是western中重要的一步,但是是不是每次都要做,答案显然是否定的.只有在需要得到可发表的结果的情况下,才有必要做一个漂亮的内参.1: western本身就是一个很粗略的定量方法,严格的说,根本不具有定量的能力,所有从werster里出来的表达量的区别(明显的“有”“没有”的区别属于定性），都是不精确的，苛刻点说，压根就是不可采信的。所以内参只是一个为了结果完整性而出现的东西，平时做western如果次次做内参，完全没有必要，也没什么太大帮助

2: 那么如何控制上样量，有很多办法，可以通过SDS-PAGE粗略判定，这个方法一点不比用内参差，那些abundant protein在胶上完全可以通过肉眼辨别条带的深浅，反倒是用western判断很困难，在western结果出来都是很黑的条带，不一定在胶上看起来就一样.而最直接的办法是在准备sample的时候就下好功夫，取多少个细胞，最终溶解在多少sample buffer里面，是可以控制出load的时候每条lane大概有多少细胞的.内参，尤其是werstern的内参，绝大多数情况是作为“漂亮的马后炮”出现的,当你前期控制完之后，再放上一个内参告诉别人“看，的确如我所料”.werstern次次做内参,完全没有必要

要发文章还是要用内参更有说服力，前面的同志们在讨论的时候主要针对的是动物体系，不知生物公司的内参一抗对植物材料WB是否通用？我想请教一下；做水稻受病原菌处理后线粒体的蛋白的变化，采用什么内参比较好？一般病原菌处理植物后发生的PCD会不会影响action的表达差异性？选择GAPDH可以吗？希望针对植物蛋白和动物蛋白在WB过程中选择内参需要注意的事项进行交流讨论！

可供选择的内参除了前面说过的actin和tubulin，还有Ubquitin，elgf等。但是，最重要的是一定要确定试验的处理因素不会对选择的内参蛋白表达产生影响，比如常用的tubulin，可能就不太适合用来定量有丝分裂相期的蛋白表达情况。因此，如果有条件，最好在预实验中平衡比较一下多种内参再选择最优。当然，对于我们大多数人来说，只要回顾一下本研究领域的权威参考文献，大概就可以确定哪种内参在这种实验中已经得到公认了！

关于内参的应用问题，国内一直还没有形成应用的习惯，可能是有研究水平的原因，也有可能是内参的抗体大部分是国外产的，超级贵！前段时间为了一篇文章，用的内参外国人老不相信，老板一狠心买了两只chemicon内参，50ug包装，每支3000多！不过好在我们有自己做的一支很好用的内参单抗，平常的实验可以保证敞开用，国内其他大部分实验室可能就没这么好的运气了！但是老板经过此事也下决心要把这个抗体完整详细的鉴定出来，然后推出去让大家都来用提高它的可信度。目前，鉴定的工作已经差不多完成了，剩下的就是申请专利，不管最后是怎么卖出去，国产的东西应该会大大便宜于国外的，这对大家来说可能也算一个好消息吧

不太苟同 sixday1004兄对内参的某些看法.sixday1004 wrote: 我来说点不同看法

内参是western中重要的一步,但是是不是每次都要做,答案显然是否定的.只有在需要得到可发表的结果的情况下,才有必要做一个漂亮的内参.这么肯定的将内参的作用局限在“需要得到可发表的结果的情况下”的狭小范围内，似乎有些不妥。科研过程中，有谁能未卜先知到实验结果？没有内参的作用，我们如何得知得到的结果就是“可发表的结果”？

1: western本身就是一个很粗略的定量方法,严格的说,根本不具有定量的能力,所有从werster里出来的表达量的区别(明显的“有”“没有”的区别属于定性），都是不精确的，苛刻点说，压根就是不可采信的。所以内参只是一个为了结果完整性而出现的东西，平时做western如果次次做内参，完全没有必要，也没什么太大帮助

western的确是一种半定量的方式，不是很精确，但这决不是因噎废食甚至是“破罐子破摔”的理由。内参的出现，就是为了在一定程度上弥补WB的不足而必须的一种实验设计，只有这样我们才有可能对每次的WB结果进行分析。请注意，内参不是完整性结果的“果”或“附属品”，而是“因”或“前提”，颠倒了两者的关系，可不是一种科学严谨的实验态度哦。

当然，如果是同一批样品，在保证上样体积一致的情况下，是可以不必次次做内参的。

2: 那么如何控制上样量，有很多办法，可以通过SDS-PAGE粗略判定，这个方法一点不比用内参差，那些abundant protein在胶上完全可以通过肉眼辨别条带的深浅，反倒是用western判断很困难，在western结果出来都是很黑的条带，不一定在胶上看起来就一样.而最直接的办法是在准备sample的时候就下好功夫，取多少个细胞，最终溶解在多少sample buffer里面，是可以控制出load的时候每条lane大概有多少细胞的.WB结果出来很深的条带，那是因为曝光时间太长的缘故，可以适当减少曝光时间或通过其它有效方法来降低条带的亮度，这样之后还是能够很容易在胶片上判别的。条带的亮度与上样量并不是一直都是线形关系的，不仅WB如此，考马斯亮蓝染色也是如此。SDS-PAGE上的丰度蛋白本身就具有很多不确定性，比起已知的内参，利用其作为判定标准更在无形中增加了判断误差的风险。

比较认同您关于“准备样品时下好功夫”的观点，不仅仅是可以尽量保证总蛋白量的一致，更重要的是良好的蛋白样品会有好的电泳行为，直接影响到WB条带的质量。即便如此，每次准备样品后，内参还是要有的。

内参，尤其是werstern的内参，绝大多数情况是作为“漂亮的马后炮”出现的,当你前期控制完之后，再放上一个内参告诉别人“看，的确如我所料”.“漂亮的马后炮”，我们的确也常在茶余饭后这样调侃内参的作用。但在实验中，它的确是我们评价实验结果的“基石”，只有这样，我们才能理直气壮的指着内参告诉别人，“看，的确如我所料”。

werstern次次做内参,完全没有必要

请sixday1004兄三思，指教。

个人观点，仅对事，仅供参考。

做内参的目的是为了保证蛋白上样量相近/相等.仔细想一下到底有多少实验需要相对精确的上样量就知道了,其实并没有太多.1: 如果你是为了做kinetic aey之类的,那么蛋白量是需要相当的精确,靠WB的内参显然是远远不够的

2: 如果是为了detect到不同sample蛋白量的区分,那是需要并且如果想发表,结果中是必定要有内参的.但是,依然有精确度的问题.倘若变化范围很小,光靠内参有说服力么?还是要回到更精确的蛋白定量上去;而倘若范围变化很大,例如RNAi之类的,又需要用到内参这样相对“精确”的方法么? SDSPAGE甚至sample制备的时候做的一些控制已经绰绰有余了.3: 还有一个是顺序问题,请问有哪个人在做RNAi screening之类实验的时候,每个sample做内参的?都是挑好clone了之后想做个发表结果的图的时候才放上内参的吧.否则先不谈浪费antibody的问题,光是花掉的时间和获得的效果,有性价比么?很多人做fusion protein detection的时候甚至连SDS-PAGE都省了,直接上DOT BLOT(一般买的tag antibody质量都很好).内参用在一些“关键性”的情况下才有意义.并且这个范围还很狭小,既不能太小(内参不够精确),也不能太大(SDSPAGE可以做到同样效果).4: 至于LS某人提到的习惯问题,我只想说..国外好象也没听过WB次次用内参的,这个和科研水平高低毫无关系,因地制宜吧,不用这么死板.WB常用内参及其技术参数

内参名称 分子量大小 适用范围 beta-actin 43kDa 胞浆和全细胞 GAPDH 30-40kDa 胞浆和全细胞 Tubulin 55kDa 胞浆和全细胞 VCDA1/Porin 31kDa 线粒体 COXIV 16kDa 线粒体 TBP 38kDa 细胞核