脂肪酶发酵条件优化_脂肪酶发酵优化

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脂肪酶产生菌的发酵条件优化即其脂肪酶的分离纯化

一、实验仪器及药品

仪器：显微镜、血球计数板、旋转式恒温摇床、电子天平、pH计、生化培养箱、低速离心机、高速离心机、离子交换柱、透析袋、磁力搅拌器

药品：NaCl、琼脂粉、蛋白胨、K2HPO4、KH2PO4、Na2HPO4·2H2O、酵母浸膏、(NH4)2SO4、MgSO4·7H2O、蔗糖、橄榄油、聚乙烯醇(PVA)、NaOH、邻苯二甲酸氢钾(C8H5O4K)、硫酸铵、95%乙醇、氯化钡、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、DEAE-Sepharose FF、浓HCl、酚酞

二、培养基及试剂的配制

培养基的配制：

斜面培养基(g/l)：琼脂20.0、蛋白胨5.0、NaCl 3.0、K2HPO4 1.0、酵母浸膏 5.0。种子培养基(g/l)：蛋白胨5.0、蔗糖 5.0、NaCl 3.0、K2HPO4 2.0、酵母浸膏 5.0。

发酵培养基(g/l)：蛋白胨20.0、蔗糖 5.0、橄榄油 5.0、(NH4)2SO4 1.0、MgSO4·7H2O 1.0、K2HPO4 1.0。加蒸馏水 1000 ml，加热溶解，分装后 121℃灭菌 30min。试剂的配制：

①、2%的聚乙烯醇(PVA)溶液：称取20g聚乙烯醇（PVA）放入800mL蒸馏水中，边搅拌边加热，使其完全溶解，自然冷却后加蒸馏水定容至1000ml，然后用双层纱布过滤，保存滤液备用。

②、4%的聚乙烯醇(PVA)溶液：称取40g聚乙烯醇（PVA），其他同上。

③、橄榄油乳化液：取橄榄油与聚乙烯醇（4%）按1:3比例混合，用高速组织搅拌机搅拌乳化3-5min，4℃保存备用。

④、0.025mol/L pH7.5磷酸缓冲液：

甲液：称取KH2PO417.01g，加300ml蒸馏水溶解再定容至500ml。

乙液：称取Na2HPO4·2H2O 44.77g，加300ml蒸馏水溶解再定容至500ml。

吸取甲液13mL加乙液100mL，即成pH7.5，0.25mol/L磷酸缓冲液。以酸度计校正pH。使用时用蒸馏水稀释10倍，即成0.025M磷酸缓冲液。⑤、0.05mol/LNaOH溶液：

秤取NaOH 2g，用500ml蒸馏水溶解，再定容至1000ml，用邻苯二甲酸氢钾标定。标定：精确称取105℃干燥至恒重的邻苯二甲酸氢钾(C8H5O4K)0.5000g置250mL三角瓶中，加50ml煮沸后冷却的蒸馏水溶解，再加2滴1%酚酞指示剂(以95%中性酒精配制)以待标定的0.05mol/L NaOH滴定至微红色为终点。NaOH的浓度为N=W/（V*0.2042）式中

W——邻苯二甲酸氢钾的克数；

V——滴定消耗NaOH溶液的毫升数；

0.2042——邻苯二甲酸氢钾的毫克摩尔数。

⑥、饱和硫酸铵溶液：秤取561g硫酸铵溶于1000ml蒸馏水中，溶解时加热以加速溶解，然后冷却吸取上清液即为饱和硫酸铵溶液。⑦0.02mol/L pH7.5的Tris一HCl缓冲液：

0.04mol/L tris：秤取4.84g tris于烧杯，加500ml蒸馏水溶解，再定容至1000ml； 0.04mol/L HCl：量取浓HCl（37.5%，12mol/L）3.33ml，加500ml蒸馏水溶解，定容至1000ml 再用500ml0.04mol/Ltris 与403ml0.04mol/LHCl混合，定容至1000ml既得。

三、菌种活化及发酵条件优化

1、菌种的活化

用接种环接种一定菌体于斜面培养基的试管内，30℃培养2-3d，待细菌长出明显菌株，备用。

2、制备菌悬液

将 0.85%无菌 NaCl溶液 10 mL 加入上述活化的长有菌株的试管里，用接种环刮下菌体，用自制灭菌棉过滤。漩涡震荡得菌悬液，血球计数板计数，计算细菌浓度。

3、基准种子液的培养

以1.0×107个/ml 基准浓度为标准，每20ml种子培养基中接入200μl孢子悬液，30℃、150 r/min 摇床培养 24 h后备用。

4、生长曲线的测定

按接种量为 2%(v/v)取液体种子于含有发酵培养基（25ml）的三角瓶中，以30℃、150 r/min下摇瓶培养 3 d。培养期间于6h、12h、18 h、24h、30h、36 h、42 h、48h、54h、60 h、66 h、72h时分别取样，于4000 r/min离心15min分别获得上清液与沉淀，沉淀获得菌体，并用 pH 计测定发酵液 pH 值。将菌体置于 105℃烘箱中，失水至恒重，测菌体干重。同时用上清液测定各个取样点的发酵液脂肪酶酶活。绘制生长曲线，确定获得最大酶活力时的培养时间。

5、脂肪酶活力测定（NaOH滴定法）：

取2只100ml三角瓶，分别于空白瓶(A)和样品瓶(B)中各加PVA橄榄油乳化液4mL和0.025mol/L pH7.5磷酸缓冲液5ml(应把附在瓶壁上的乳化液冲下)，再于A瓶中加入95%乙醇15mL。置40℃水浴内预热5分钟，然后在两瓶中各加入酶液lmL立即记时，反应15分钟后，在B瓶中立即加入95%乙醇15mL中止反应，加酚酞指示剂3滴，用0.05mol/L标准NaOH滴定至微红色为终点，两组消耗的NaOH溶液分别为V1、V2。对照样品的乙醇应在酶液前加入。

酶活力定义：40℃条件下，15min油脂水解反应，每min催化脂肪水解产生1μmol脂肪酸的脂肪酶量定义为一个脂肪酶活单位（U/mL）。酶活力单位（U/mL）=（V1一V2)×N×25/作用时间(min)

N--标定了的NaOH溶液的浓度。

6、摇瓶发酵实验

以接种量2%(v/v)的液体种子接种于发酵培养基，在30℃，150 r/min 进行发酵产酶试验（培养时间为生长曲线测定时得到的时间），发酵液于4000 r/min离心15min获得上清液，测定其脂肪酶酶活。

7、发酵培养条件的优化（1）、接种量对菌株产脂肪酶的影响

接种量的多少对微生物生长发酵周期和目标酶的产量都有较大影响。接种量偏小，生长周期缓慢，发酵周期延长，不利于产酶。接种量偏大，减少了培养基成分的有效利用率，使得发酵环境恶化，改变产酶时间及酶活水平。因此，恰当的接种量，不但可以缩短发酵周期，而且还能获得较高的产酶水平。

实验分别以 1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%的液体种子的接种量（V/V）接种发酵培养基。于30℃，150 r/min 进行发酵产酶培养（培养时间为生长曲线测定时得到的时间）。发酵液于4000 r/min离心15min获得上清液，分别测定其脂肪酶酶活，确定最佳接种量。（2）、初始 pH菌株产脂肪酶的影响

初始 pH 作为微生物生存的外部环境之一，对其发酵也有一定的影响。使用NaOH（0.1mol/L）或 HCl（0.1mol/L）溶液，调整培养基的起始 pH为5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9之间。以（1）中确定的最佳接种量接种培养基，于30℃，150 r/min 进行发酵产酶培养（培养时间为生长曲线测定时得到的时间）。测定不同初始 pH 条件下摇瓶操作培养，收集发酵液，于4000 r/min离心15min获得上清液，分别测定脂肪酶活力。确定最佳pH。（3）、发酵温度对菌株产脂肪酶的影响

不同的发酵温度对微生物生长及代谢产物的分泌有很多的影响。实验按（2）中确定的最佳pH配制发酵培养基，以（1）中确定的最佳接种量接种培养基，分别于26℃、28℃、30℃、32℃、34℃、36℃条件下，150 r/min 进行发酵产酶培养（培养时间为生长曲线测定时得到的时间）。收集发酵液，于4000 r/min离心15min获得上清液，分别测定脂肪酶活力。确定最佳培养温度。

四、酶的分离纯化

1、发酵培养

按上述发酵条件优化后确定的条件进行发酵罐发酵培养。

2、脂肪酶粗酶液的制备

发酵液经过滤，4℃、8000 r/min离心15min，分别收集上清液（粗酶液）与沉淀备用。

3、测定脂肪酶酶活

分别测定上清液及其沉淀蛋白（沉淀先用与上清液等体积0.025mol/L pH7.5磷酸缓冲液溶解再测酶活）的酶活。

4、硫酸铵盐析

(1)、硫酸铵分级盐析

分别取30ml粗酶液，加入饱和硫酸铵至饱和度分别为20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%静置4h左右，并保证在低温条件下对粗酶液进行沉淀，便可得到不同饱和度下的蛋白质沉淀。分别测定上清液及其沉淀蛋白（沉淀先用与上清液等体积0.025mol/L pH7.5磷酸缓冲液溶解再测酶活）的酶活，确定硫酸铵沉淀最适饱和度。（2）、硫酸铵沉淀的透析除盐

发酵上清液经硫酸铵沉淀后，取其有最大酶活沉淀用20mmol/L pH7.5的Tris一HCl缓冲液充分溶解，沉淀溶解酶液经过20mmol/L pH7.5的Tris一HCl缓冲液(缓冲液可再加少许0.1M的HCl)透析，低温慢速搅拌透析系统，隔4h换一次透析缓冲液，氯化钡检测透析液直至无白色沉淀产生，然后收集、离心(10000r/min，4℃，30min)取上清，上清酶液冻干呈粉末状，再用少量20mmol/L pH7.5的Tris一HCl缓冲液把可溶的蛋白溶解出来，从而达到浓缩富集效果。

5、DEAE-Sepharose FF 离子交换层析 ①、装柱：20mmol/L pH7.5的Tris一HCl缓冲液冲洗柱子。缓缓倒入DEAE-Sepharose FF 湿胶约30 ml，待分成后，倒去乙醇溶液，再次加入20mmol/L pH7.5的Tris一HCl缓冲液。②、平衡：装柱后，使用 20mmol/L pH7.5的Tris一HCl缓冲液冲洗柱子，速度约为1ml/min。平衡时间为 5h以上，直至液相层析系统记录器显示为基准线。

③、上样和洗涤：脱盐浓缩后的蛋白质样品液5ml上样于离子交换柱。用20mmol/L pH7.5的Tris一HCl缓冲液冲洗，直至冲洗去除杂蛋白后，仪器紫外检测仪出现平稳吸光值（即待穿透峰出现后）。

④、洗脱：用浓度为0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35、0.4、0.45、0.5mol/L浓度梯度的NaCl溶液进行浓度梯度洗脱(流速为0.6mL/min)。洗脱体积为15倍柱体积，最后以1 mol/L NaCl溶液彻底洗脱结合蛋白。分步收集洗脱液进行分析，合并酶活高的组分。