病毒分子生物学鉴定常用技术_常用分子生物学技术
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实验二十三
病毒核酸检测常用技术
（Techniques of Detecting Nucleic Acid of Viruses in
Common Use）
近年来随着分子生物学的发展，基因检测技术在微生物学实验室诊断中也取得了长足的进展。由于部分病原微生物的基因组已成功地被克隆并进行了核苷酸序列测定，因此根据病原微生物的基因特点，应用分子生物学技术检测样品中有无相应病原微生物的核酸，从而可以特异、灵敏地判定标本中是否含有相应的病原微生物。在微生物学的研究及感染性疾病的诊断中，最常使用的微生物核酸检测技术有PCR、RT-PCR、核酸杂交等技术，现对病毒核酸（DNA、RNA）的分离、PCR、RT-PCR、核酸杂交等技术的基本原理、操作方法、应用及影响因素等进行概述。
实验 1 PCR 检测传染性喉气管炎病毒核酸
【目的要求】
通过本实验使学生初步了解和熟悉病毒核酸（DNA）的分离与PCR技术的基本原理、操作方法、影响因素和应用。
【基本原理】
鸡传染性喉气管炎(Infectious laryngotracheitis, ILT)是由疱疹病毒科、α-疱疹病毒亚科的喉气管炎病毒(Infectious laryngotracheitis Virus, ILTV)引起的一种急性上呼吸道传染病, 常表现呼吸困难、产蛋鸡产蛋下降和死亡, 是危害养鸡业发展的重要疫病之一。但在临诊上极易与其它一些呼吸道疾病相混淆, 如禽流感、新城疫、传染性支气管炎、支原体感染等。常规检测IL TV 的方法有病原分离鉴定和血清学试验, 这些方法虽经典，但费时且敏感性差, 不能检测亚临床感染, 而传染性喉气管炎潜伏感染是疾病的一种重要表现形式。聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，PCR）是目前比较快速、敏感、特异的检测手段，已被广泛应用在病毒核酸检测方面。本实验以PCR方法检测鸡传染性喉气管炎病毒核酸为例，对PCR方法进行介绍。
PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，典型的PCR由（1）高温变性模板；（2）引物与模板退火；（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。其主要步骤是：将待扩增的模板DNA置高温下（通常为93～94℃）使其变性解成单链；人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；耐热的DNA聚合酶（Taq酶）在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板从5’→3’方向延伸，合成DNA的新互补链。如此反复进行，每一次循环所产生的DNA均能成为下一次循环的模板，每一次循环都使两条人工合成的引物间的DNA特异区拷贝数扩增一倍，PCR产物得以2n的批数形式迅速扩增，经过25～30个循环后，理论上可使基因扩增109倍以上，实际上一般可达106～107倍（图23-1）。
图23-1 PCR基本原理示意图
本实验是将被检样品中ILTV 颗粒经裂解、变性后，分离ILTV—DNA。选择鸡传染性喉气管炎病毒的TK基因保守序列设计引物，由于引物与鸡传染性喉气管炎病毒的TK基因存在着特异的互补性，当加入DNA聚合酶后，就会在引物的引导下合成该段基因，该基因片段通过人工扩增后，经含溴乙锭的琼脂糖凝胶电泳，在紫外灯下可显示橙红色ILTV—DNA条带，根据片段大小来判定标本中鸡传染性喉气管炎病毒的存在。
【器材准备】
1．病毒裂解液：醋酸钠1.7g，EDTA钠盐4.65g，20mg/ml蛋白酶K 2.5ml，100g/L SDS 10ml，DEPC三重蒸馏水加至50ml。
2.3mol/L醋酸钠缓冲液(pH 5.2)，酚/氯仿/异戊醇混合液(25：24：1)，无水乙醇及70％乙醇。
3.2.5mmol dNTPs：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2.5mM。
4.10×PCR Buffer，Taq DNA聚合酶。
5.DNA分子量标准。
6.上样缓冲液：2.5g/L溴酚蓝、400g/L蔗糖水溶液。10mg/ml溴乙锭(EB)(具致癌性，操作时应戴手套)，琼脂糖。
7.50×TAE缓冲液：242g Tris，57.1mL 冰乙酸，100mL 0.5mol/L EDTA（pH8.0）加三蒸水定容到1000mL。使用液为1×。
8.ILTV北京E2 株、ILTV-DNA可疑组织样品、ILTV-DNA阴性组织样品等。
9.引物序列: 参考已发表的ILTV的TK基因序列,设计并合成了一对引物,其序列如下：引物P1：5’-TTCGAGAACGATGACTCCG-3’；引物P2：5’-ATAGTCATCTGAACTTCCGC-3’。
10.仪器：台式高速离心机、PCR扩增仪、电泳仪、水平式电泳槽、紫外透射反射分析仪、微量加样器、Eppendorf 管与吸头等。
【实验步骤】
1.病毒核酸的分离
（1）取ILTV-DNA可疑组织样品上清液200μL、病毒裂解液20μL于Eppendorf管中，60℃水浴1h，同时设ILTV北京E2 株、ILTV-DNA阴性组织样品对照。
（2）加酚/氯仿/异戊醇混合液200μL，上下颠倒混匀，14000rpm离心5min，吸上清液于另一新的Eppendorf管中。
（3）加1/10体积的3 mol/L醋酸钠缓冲液(pH 5.2)及2倍体积的无水乙醇，-20℃过夜。14000rpm离心15min，弃上清液。
（4）加70％乙醇至Eppendorf管2/3处，混匀，洗涤沉淀。14000rpm离心15min，弃上清液，室温中使乙醇挥发。
2.加样及PCR扩增
（1）按以下次序将各成分加入0.5ml 灭菌Eppendorf管中。
10×PCR bufferμl 2.5mM dNTPs μl
引物P1（25pmol/μL）μl
引物P2（25pmol/μL）μl Taq DNA聚合酶（5U/μl）
0.5 μl 模板液（病毒核酸的分离液）μl 加ddH2O至
μl
（2）将上述混合液稍加离心，调整好反应程序，立即置PCR仪上，执行扩增。一般在94℃预变性3min，进入循环扩增阶段：94℃ 60s→58℃ 30s→72℃ 60s，循环30-35次，最后在72℃保温7min。
3.电泳检测
（1）将倒胶槽两端用透明胶带封闭并放置在水平的台面上，放好梳板，使梳板齿下沿距倒胶槽板1mm。
（2）配制合适浓度的琼脂糖凝胶，如配制1.2％的凝胶，则称取琼脂糖1.2g于三角瓶中，加入100ml 1×TAE电泳缓冲液，置微波炉中加热煮沸后以蒸馏水补足体积至100ml，迅速混匀，待冷至60℃左右时，加入100μL 0.5mg/ml的EB液，充分混匀。倒胶至倒胶槽内，使厚度为3～5mm，排除气泡后待胶完全凝固，撕去两端胶带。
（3）将倒胶槽置电泳槽中，加入1×TAE电泳缓冲液使其没过胶面2～3mm，轻轻拔出梳板。
（4）加样：取2μL上样缓冲液于Parafilm膜上，加入PCR产物5μL，混匀后，加入点样孔中，不要溢出孔外。同时设DNA分子量标准。
（5）电泳：样品在负极端，接通电源，5V/cm恒压电泳30～60min即可。
（6）检测：电泳结束，关闭电泳仪电源，取出倒胶槽，将电泳完毕的琼脂糖凝胶放在紫外灯300nm下观察，可见桔红色明亮带，根据电泳条带的位置判断结果。
4.结果判定
在阳性对照孔出现相应扩增带、阴性对照孔无此扩增带时判定结果。若样品扩增带与阳性对照扩增带（约265bp）处于同一位置，则判定为ILTV-DNA阳性，否则判定为阴性。
【注意事项】
1.所有实验结果都有成功或失败，实验的失败可能是应该出结果而没有出，我们把它称作假阴性，不该出结果而出了结果我们把它称为假阳性。PCR实验中最常见的问题就是假阴性和假阳性问题。
（1）假阴性：出现假阴性结果最常见的原因有Taq DNA聚合酶活力不够，或活性受到抑制；引物设计不合理；提取的模板质量或数量不过关以及PCR系统欠妥当；循环次数不够。为了防止假阴性的出现在选用Taq DNA聚合酶时，要注意用活力高、质量好的酶。同时在提取PCR模板时，应特别注意防止污染抑制酶活性物质（如酚、氯仿）的存在。尽管Taq DNA聚合酶对模板纯度要求不高，但也不允许有破坏性有机试剂的污染。保证引物的3’端与靶基因的互补。PCR反应的各温度点的设置要合理。
（2）假阳性：PCR反应的最大特点是具有较大扩增能力与极高的灵敏性，但令人头痛的问题是易污染，极其微量的污染即可造成假阳性的产生，所以污染是PCR假阳性的主要根源。污染的原因可能有：
① 样品间交叉污染。样品污染主要有收集样品的容器被污染，或样品放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有样品而造成相互间交叉污染；样品核酸模板在提取过程中，由于移液器污染导致样品间污染；有些微生物样品尤其是病毒可随气溶胶或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染。
② PCR试剂的污染。主要是由于在PCR试剂配制过程中，由于移液器、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。
③ PCR扩增产物污染。这是PCR反应中最主要最常见的污染问题，因为PCR产物拷贝量大，远远高于PCR检测数个拷贝的极限，所以极微量的PCR产物污染，就可造成假阳性。还有一种容易忽视，最可能造成PCR产物污染的形式是气溶胶污染在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染移液器的反复吸样都可形成气溶胶而污染。
④ 实验室中克隆质粒的污染。在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个问题也比较常见，因为克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力，其污染可能性也很大。
为了避免因污染而造成的假阳性，PCR操作时采取如下措施：
① 合理分隔实验室。将样品的处理、配制PCR反应液、PCR循环扩增及PCR产物的鉴定等步骤分区或分室进行，特别注意样本处理及PCR产物的鉴定应与其它步骤严格分开，最好能划分①标本处理区；②PCR反应液制备区；③PCR循环扩增区；④PCR产物鉴定区。
② 移液器：移液器污染是一个值得注意的问题，由于操作时不慎将样品或模板核酸吸入移液器内或粘上枪头是一个严重的污染源，因而加样或吸取模板核酸时要十分小心，吸样要慢，吸样时尽量一次性完成，忌多次抽吸，以免交叉污染或产生气溶胶污染。
③ 预混和分装PCR试剂：所有的PCR试剂都应小量分装，如有可能，PCR反应液应预先配制好，然后小量分装，-20℃保存，以减少重复加样次数，避免污染机会。另外，PCR试剂与反应液应与样品及PCR产物分开保存，不应放于同一冰盒或同一冰箱。
④ 防止操作人员污染，手套、吸头、小离心管应一次性使用。
⑤ 设立适当的阳性对照和阴性对照，阳性对照以能出现扩增条带的最低量的标准核酸为宜，并注意交叉污染的可能性，每次反应都应有一管不加模板的试剂对照及相应不含有被扩增核酸的样品作阴性对照。
⑥ 减少PCR循环次数，只要PCR产物达到检测水平就适可而止。
⑦ 选择质量好的Eppendorf管，以避免样本外溢及外来核酸的进入，打开离心管前应先离心，将管壁及管盖上的液体甩至管底部，开管动作要轻，以防管内液体溅出。
2.注意个人防护和环境保护，电泳中用到的EB（Times New Roman体）可诱发基因突变，试验中被EB污染的物品要有专用收集处，并通过焚烧作无害化处理。
3.实验用品应专用，实验前应将实验室用紫外线照射以破坏残留的DNA或RNA。总而言之，PCR的条件是随系统而异的，并无统一的最佳条件，先选用通用的条件扩增，然后可以通过稍稍改变各参数，使反应条件得到优化，以取得优良的特异性和产率。
【实验报告】
1.实验结果（1）你所做的PCR实验阳性对照是否出现相应扩增带? 如果有扩增带，请对你的试验结果进行描述。如果失败，请分析其原因。
2.思考题
（1）PCR技术的基本原理？
（2）影响PCR实验成功的因素有哪些？
（3）PCR检测中出现假阳性，可能导致的因素有哪些？
（4）根据实验过程中的体会，总结如何做好PCR实验？关键因素有哪些？
实验2 RT-PCR检测猪繁殖与呼吸综合征病毒核酸
【目的要求】
通过本实验使学生初步了解和熟悉病毒核酸（RNA）的分离与RT-PCR技术的基本原理、操作方法、影响因素和应用。
【基本原理】
猪繁殖与呼吸综合征(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome, PRRS)是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine Reproductive and Respiratory Syndrome Virus, PRRSV)引起的一种传染病,其临诊特征为各种年龄的猪均可感染,病猪厌食、嗜睡、体温升高,妊娠母猪发生早产、流产、死胎、弱胎和木乃伊胎,种公猪性功能下降,仔猪和育肥猪呼吸障碍。1987年该病首次报道于美国,随后迅速蔓延北美、欧洲及亚洲各国,目前已成为一种地方性流行病。1996年初,我国也报道了本病的发生。由于PRRS与其它引起猪繁殖障碍的疾病存在着非常类似的临诊症状,根据现场诊断很难做出准确鉴别。实验室诊断方面,如病毒的分离与鉴定,抗原及抗体的检测等方法或特异性、敏感性差,或操作技术复杂、费时费力等缺点,不能满足临床需要。PRRSV属动脉炎病毒科成员，有囊膜，基因组为单股正链RNA，大小约15kb。反转录-聚合酶链式反应（Reverse Transcript-Polymerase Chain Reaction，RT-PCR）方法具有特异、敏感、快速诊断等优点，因此PRRSV适用RT-PCR方法进行检测。
RT-PCR是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，它是以RNA为模板，根据碱基配对原则，按照RNA的核苷酸顺序合成DNA。这一过程与一般遗传信息流转录的方向相反，故称为反转录，催化此过程的DNA聚合酶叫做反转录酶(reverse transcriptase)。基本过程是以dNTP为底物，以RNA为模板，按5’→3’方向，合成一条与RNA模板互补的DNA单链，这条DNA单链叫做互补DNA(complementary DNA, cDNA)，它与RNA模板形成RNA-DNA杂交体。随后又在反转录酶的作用下，水解掉RNA链，再以cDNA为模板合成第二条DNA链。至此，完成由RNA指导的DNA合成(图23-2)，然后将DNA进行PCR扩增。PCR扩增的基本原理见实验1部分。
图23-2 RT-PCR基本原理示意图
【器材准备】
1.TRIzol LS Reagent RNA提取试剂。2.氯仿、异丙醇、70%乙醇。
3.DEPC处理水：按1∶1000的比例将DEPC加入三蒸水，室温放置12h以上。4.5×反转录反应缓冲液。
5.SuperScriptTMⅡ反转录酶（200U/μL）。6.RNA酶抑制剂(40U/μL)。
7.2.5 mM dNTPs：含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2.5 mM。
8.10×PCR Buffer、Taq DNA聚合酶。9.DNA分子量标准。
10.上样缓冲液：2.5g/L溴酚蓝、400g/L蔗糖水溶液。10mg/ml溴乙锭(EB)(具致癌性，操作时应戴手套)，琼脂糖。
11.50×TAE：242g Tris，57.1mL 冰乙酸，100mL 0.5mol/L EDTA（pH8.0）加三蒸水定容到1000mL。使用液为1×。
12.PRRSV标准毒株、PRRSV-RNA可疑组织样品、PRRSV-RNA阴性组织样品等。13.引物：
（1）反转录引物：可用随机引物（Random Primers）（市售）、Oligo（dT）12-18（市售）或Random Primers与Oligo（dT）按3：1混合而成的引物Oligo（dT）/Random primer，或用相对PRRSV RNA来说的PCR下游单侧特异性引物。
（2）PCR引物序列：以高度保守的ORF7作为扩增靶区设计并合成一对引物，序列如下：引物F：5-ATGCCAAATAACAACGGCAAGC；引物R：5-TTAATTTGCACCCTGACTG-3。
14.仪器：台式高速离心机、PCR扩增仪、电泳仪、水平式电泳槽、紫外透射反射分析仪、微量加样器、Eppendorf 管、吸头与水浴箱等。
【实验步骤】
1.病毒核酸（RNA）的分离：病毒核酸（RNA）分离方法很多，实际应用时可灵活考虑。本实验选择市售商品化TRIzol LS Reagent RNA提取试剂完成猪呼吸与繁殖障碍综合征病毒(PRRSV)基因组RNA的分离。操作按TRIzol LS Reagent RNA提取试剂使用说明书进行，步骤如下：
（1）在1.5mL离心管中加入250μL的PRRSV细胞培养物和750μL TRIzol LS，盖上管盖，倒置混匀，室温放置10min。
（2）加入200μL氯仿，将匀浆剧烈振荡15sec，室温静置5min使核蛋白质复合体彻底裂解。
（3）4℃ 12 000 rpm离心15min，将上层含RNA的水相移入一新管中。为了降低被处于水相和有机相分界处的DNA污染的可能性，不要吸取水相的最下层。（4）加入等体积的异丙醇，充分混匀液体，室温放置10min。
（5）4℃ 12 000 rpm离心15min，弃上清，再用70%的乙醇洗涤沉淀，然后离心，再用吸头彻底吸弃上清，在自然条件下干燥沉淀，溶于适量DEPC处理的水中。直接用于RT-PCR或-80℃贮存，备用。
（6）另外，也可选择异硫氰酸胍法完成PRRSV RNA的提取。2.病毒cDNA第一链的合成（反转录，RT）
病毒cDNA第一链的合成参照Invitrogen公司的SuperScriptTMⅡ反转录酶使用说明进行，步骤如下：
（1）于微量离心管中加入6μL RNA、2μL反转录引物：Oligo（dT）/Random primer混合物，混匀，65℃ 5min。（2）冰浴2min，离心。（3）继续加入以下组分：
5×反转录反应缓冲液 4μL 0.1 m M DTT 2μL 2.5mmol dNTPs 2μL SuperScriptTMⅡ反转录酶 1μL（200U/μL）RNA酶抑制剂 0.5μL（40U/μL）DEPC水 2.5μL（4）混匀，42℃水浴50min，最后70℃水浴15min，完成cDNA链合成。取出后可以直接进行PCR，或者放于-20℃保存备用。试验中同时设立阳性和阴性对照。
3.PCR扩增
根据扩增目的选择引物F与引物R，按TaKaRa公司Ex-Taq DNA 聚合酶使用说明进行，步骤如下：
按以下次序将各成分加入0.5ml 灭菌Eppendoff管中。
双蒸灭菌水 37.5μL 反转录产物 4μL 引物F（25pmol/μL）0.5μL 引物R（25pmol/μL）0.5μL 10×PCR Buffer 5μL 2.5mmol dNTPs 2μL Taq酶 0.5μL（5U/μL）
注意首先加入双蒸灭菌水，然后再按照顺序逐一加入上述成分，每一次要加入到液面下。
（4）全部加完后，混悬，瞬时离心，使液体都沉降到Eppendorf管底。（5）在PCR扩增仪上执行如下反应程序：94℃ 3min；94℃ 30 sec，50℃ 45 sec，72℃ 1min，30个循环；最后72℃延伸10min结束。可根据扩增目的基因的不同，选择不同的循环参数。
4.电泳检测
（1）将倒胶槽两端用透明胶带封闭并放置在水平的台面上，放好梳板，使梳板齿下沿距倒胶槽板1mm。
（2）配制合适浓度的琼脂糖凝胶，如配制1.2％的凝胶，则称取琼脂糖1.2g于三角瓶中，加入100ml 1×TAE电泳缓冲液，置微波炉中加热煮沸后以蒸馏水补足体积至100ml，迅速混匀，待冷至60℃左右时，加入100μL 0.5mg/ml的EB液，充分混匀。倒胶至倒胶槽内，使厚度为3～5mm，排除气泡后待胶完全凝固，撕去两端胶带。
（3）将倒胶槽置电泳槽中，加入1×TAE电泳缓冲液使没过胶面2～3mm，轻轻拔出梳板。
（4）加样：取2μL上样缓冲液于Parafilm膜上，加入PCR产物5μL，混匀后，加入点样孔中，不要溢出孔外。同时设DNA分子量标准。
（5）电泳：样品在负极端，接通电源，5V/cm恒压电泳30～60min即可。
（6）检测：电泳结束，关闭电泳仪电源，取出倒胶槽，将电泳完毕的琼脂糖凝胶放在紫外灯300nm下观察，可见桔红色明亮带，根据电泳条带的位置判断结果。
5.结果判定
在阳性对照孔出现相应扩增带、阴性对照孔无此扩增带时判定结果。
若样品扩增带与阳性对照扩增带处于同一位置，则判定为PRRSV-RNA阳性，否则判定为阴性。
【注意事项】
1.分离高质量的病毒RNA是RT-PCR成败的关键。由于RNA酶无处不在，且可耐受多种处理（例如煮沸）而不失活，因此RNA在分离过程中极易受其污染而降解。为了获取完整的RNA，应创造一个无RNA酶的环境。整个操作过程应戴一次性手套并勤换。所有实验用玻璃器皿及镊子都应于实验前一日置高温（240℃）烘烤以达到消除RNA酶的目的。注意采用灭菌的一次性塑料制品，且不得重复使用；非一次性的玻璃和塑料用品须在使用前应用0.05%焦碳酸二乙酯（DEPC）室温处理过夜，然后高压灭菌去除DEPC，以确保无RNA酶；所有溶液（Tris除外）均须加入0.05% DEPC浸泡过夜后高压灭菌。
2.病毒cDNA第一链的合成（反转录）步骤（1）、（2）中，将RNA溶液置65℃中温育，然后冷却再加样目的是破坏RNA的二级结构，尤其是mRNA Poly(A+)尾处的二级结构，使Poly(A+)尾充分暴露，从而提高Poly(A+)RNA的回收率，此步骤不能省略。
3.RT-PCR过程中的PCR步骤中最常见的问题参见实验1注意事项内容。
【实验报告】
1.实验结果
（1）你所做的RT-PCR实验阳性对照是否出现相应扩增带? 如果有扩增带，请对你的试验结果进行描述。如果失败，请分析其原因。
2.思考题
（1）RT-PCR技术的基本原理？
（2）影响RT-PCR实验成功的因素有哪些？
（3）RT-PCR检测中出现假阳性，可能导致的因素有哪些？
（4）根据实验过程的体会，总结如何做好RT-PCR实验？关键因素有哪些？
实验3 核酸杂交技术检测病毒核酸
【目的要求】
通过本实验使学生初步了解和熟悉病毒核酸杂交技术的基本原理、操作方法、影响因素和应用。
【基本原理】
鸡马立克氏病(Marek’s Disease，MD)是由马立克氏病病毒(Marek’s Disease Virus，MDV)引起的鸡的一种传染性肿瘤病,它同时还能引起感染鸡的免疫抑制,从而导致对多种疫苗免疫效应降低。应用特异、敏感的方法对该病作出早期诊断是控制其流行的一项重要措施。实验室诊断MD的方法很多,到目前为止有琼脂扩散试验、免疫荧光抗体试验、酶联免疫吸附试验等,但这些方法存在敏感性低及易出现非特异性反应等缺点。近年来业已建立的一些分子生物学方法,如核酸探针技术，以其特异、快速、敏感，适合检测和早期诊断等特点,已在MDV检测及MD的诊断上得到应用。
核酸杂交技术是从核酸分子混合液中检测特定大小的核酸分子的方法。其原理主要是利用四种脱氧核苷酸中碱基配对原则(G=C、A=T)，核酸变性和复性理论（图23-3）。
图23-3核酸分子杂交原理示意图
病毒核酸杂交基本原理是将和已知病毒核酸特定区域碱基互补的DNA或RNA克隆片
32段，用非放射性物质(如生物素、地高辛)或放射性物质(如P)标记，制备成核酸分子探针。在适当条件下，核酸探针与临床样品中的病毒核酸形成双链结构而被保留，然后通过放射自显影或免疫技术检测标记的核酸片段。若被检样品与探针形成杂交双链，则显示阳性结果。如样品中无与探针互补的序列，则不发生分子杂交，结果为阴性。常用的杂交方法有DNA斑点杂交、原位杂交、Southern杂交和Northern杂交。
下面以地高辛(Dig)标记的单链DNA探针试剂盒检测MDV核酸为例，对常用的DNA斑点杂交法进行介绍。将MDV-DNA样品滴于硝酸纤维素膜上，MDV-DNA经处理变性，双螺旋DNA变为单链DNA吸附在固相滤膜上，再加分子质量较小的地高辛标记的单链DNA（即核酸探针），在一定条件下按互补碱基顺序配对的特点进行结合，形成DNA—DNA的双链杂交分子。然后用偶联有酶的抗地高辛抗体结合物作为酶标记，再分别用显色底物使杂交部位显色以达到检测目的，其反应过程见图23-4。
图23-4 地高辛标记的探针检测酶联免疫反应
【器材准备】
1.Dig-MDV-DNA探针：参照Dig-DNA探针标记试剂盒说明进行制备。2.预杂交液（pH7.0-8.6）：Ficoll 0.8ml，2.0g/L BSA 0.8ml，20g/L PVP 0.8ml，20×SSC 2ml，1 mg/m1小牛胸腺DNA 0.4ml, 双蒸水2.8ml,0.5mol/L HCl 0.4ml。
3.漂洗液（1）20×SSC：NaCl 175.32g，枸橼酸钠(2H2O)88.2g，加双蒸水至1000ml。（2）4×SSC-1.0g/L SDS：20×SSC 100ml，100.0g/L SDS 5ml，双蒸水395ml。（3）参照（2）法配制4×SSC-5.0g/L SDS、0.1×SSC-1.0g/L SDS。
（4）3mol/L NaCl-0.5mol/L Tris：NaCl 175.32g，Tris 60.5g，双蒸水395ml。
4.MDV 中国疫苗株814 株或中国标准株Jing-1 株、MDV-DNA可疑组织样品与MDV-DNA阴性组织样品等。
5.器材：负压抽滤点样器、硝酸纤维素膜、塑料袋、烤箱、水浴箱、冰箱、塑料封接机。
【实验步骤】
1.病毒DNA 分离：MDV核酸分离方法参照实验1 PCR 检测传染性喉气管炎病毒核酸部分（1.病毒核酸的分离）进行。
2.探针标记：MDV pp38基因片段DNA 特异寡核苷酸探针标记，参照Dig-DNA探针试剂盒说明书进行。
3.点样：将上述适度稀释的病毒核酸（DNA）80μl、阳性对照80μl、阴性对照80μl点样于硝酸纤维素膜(NC膜)或尼龙膜上，负压抽滤。
4.变性：用0.5 mol/L NaOH变性点样膜10min，再抽干水分按下述顺序洗膜。（1）0.5 mol/L HCl漂洗1次，每次10min。
（2）3 mol/L NaCl-0.5 mol/L Tris(pH7.5)漂洗1次，每次15min。（3）1 mol/L Tris-0.5 mol/L NaCl(pH7.5)漂洗1次，每次20min。（4）0.5 mol/L Tris-0.5 mol/L NaCl(pH7.5)漂洗1次，每次20min。（5）0.2mol/L Tris-EDTA(0.002mol/L)(pH7.5)漂洗1次，每次5min。
（6）2×SSC漂洗1次，每次5min。
（7）80℃ 5min，氯仿浸泡5min，再80℃烘干2h。
5.预杂交：将滤膜和预杂交液—起放塑料袋内密封65℃水浴5h。
6.杂交：
（1）将地高辛标记的MDV pp38基因探针放沸水中煮沸10 min ,再置冰中速冷变性。（2）在塑料袋内留有适量预杂交液，加入变性的Dig-ILTV DNA，除去气泡，充分混匀，密封，68℃摇动，杂交过夜或6 h 以上。
7.洗膜：按下列顺序充分洗去未杂交的标记物。
（1）4×SSC 1.0g/L SDS漂洗1次，每次10～30min。（2）4×SSC 5.0g/L SDS 65℃漂洗1次，每次4h。（3）0.1×SSC 1.0g/L SDS 45℃漂洗1次，每次2h。
8.显色：将杂交膜置80℃烘干30min，再装入塑料袋内，加碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体，室温显色3～4h；双蒸水洗涤，终止反应，以BCIP和NBT为底物进行显色。
9.结果判定
在阴阳对照正常的情况下，阳性标本硝酸纤维素膜点样处呈紫色。可与同时杂交的已知的MDV DNA样品显色强度相比较，进行样品中MDV DNA的定量检测。阳性与阴性结果如图23-5。
图23-5 DNA斑点杂交检测结果
【注意事项】
1.实验要设立各种对照（阳性对照、阴性对照与空白对照）。
2.非特异显色的排除。非特异显色是固相膜杂交方法常遇到的问题，指标记DNA非特异结合到空白膜上而显色，即本底。这个问题的克服一是使用高纯度的核酸制品和充分严格的杂交条件，二是选择合格的杂交反应液充分封闭膜上的非特异结合位点和对膜进行处理。
3.使用的抗体进行梯度测试，找出最佳的使用浓度。抗体的有效期和保存条件要经常检查，现在大多数试剂公司的抗体均要求在4~8℃条件下保存，应避免反复冻融，试剂保存时一定要避免与挥发性有机溶剂同放一室，以免降低抗体的效价。底物显色液最好新鲜配制，如有沉渣应进行过滤后再用。
4.显色过程最好实时监控，达到理想的染色程度时立即终止反应。
5.结果判定时，应与阳性、阴性对照进行比较，克服肉眼观察所造成的误差。
6.在实验过程中应严格注意控制污染，所用器皿需高温消毒，实验者需戴手套。另外，在处理点样硝酸纤维素膜(NC膜)或尼龙膜时，自始至终应保持湿润，勿令其干燥。
【实验报告】
1.实验结果
DNA斑点杂交实验设立的各种对照显色是否正常? 并对你的试验结果进行描述。如果失败，请分析其原因。
2.思考题
（1）核酸杂交技术的基本原理？请阐述斑点杂交法主要步骤。
（2）在斑点杂交实验中引起非特异性染色的主要因素有哪些？应如何排除？
(陈金顶)
参考文献
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8.徐秀芬，赵曼瑞，胡军.微生物与免疫学·寄生虫学实验指导.北京：人民军医出版社，2005
9.曹澍泽等主编.兽医微生物学及免疫学技术.北京：北京农业出版社，2003
