分子生物学引物设计_分子生物学引物设计

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PCR引物设计与分析

摘要：本文简单的介绍了PCR技术以及PCR引物设计原则和技巧，并以一段序列为例，介绍两种引物设计软件的使用方法。一般性引物自动搜索可采用“Premier Primer 5”软件，而引物的评价则可采用“Oligo 6”软件。关键词：PCR；引物设计；软件； 1 PCR

聚合酶链式反应（英文全称：Polymerase Chain Reaction），简称PCR。聚合酶链式反应（PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方。PCR又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。

类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性--退火（复性）--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至90~95℃一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火（复性）：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55~60℃，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在DNA聚合酶的作用下，于70~75℃，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2+。引物是PCR特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板DNA互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板DNA序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用PCR就可将模板DNA在体外大量扩增。2 引物设计原则及注意 引物设计有3条基本原则：（1）引物与模板的序列要紧密互补；（2）引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；（3）引物不能在模板的非目的位点引发DNA聚合反应（即错配）。

具体实现这3条基本原则需要考虑到诸多因素，如引物长度，产物长度，序列Tm值，引物与模板形成双链的内部稳定性，形成引物二聚体,及发夹结构的能值，在错配位点的引发效率，引物及产物的GC含量等等。必要时还需对引物进行修饰，如增加限制性内切酶位点，引进突变等。根据有关参考资料和笔者在实践中的总结，引物设计应注意如下要点：

(1)引物的长度一般为15-30bp，常用的是18-27bp，但不能大于38bp，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，会超过Taq酶的最适温度。

(2)引物3’端的序列要比5’端重要。引物3’端的碱基一般不用A，因为A在错误引发位点的引发效率相对比较高。另外引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不大，因此常用来引进修饰位点或标记物。

(3)引物的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。

(4)引物所对应模板序列的Tm值最好在72℃左右，可按公式Tm=4(G+C)+2(A+T)来粗略的估计解链温度。

(5)ΔG值(自由能)反映了引物与模板结合的强弱程度。一般情况下，引物的ΔG值最好呈正弦曲线形状，即5’端和中间ΔG值较高，而3’端ΔG值相对较低，且其绝对值不要超过9，如此则有利于正确引发反应而可防止错误引发。(6)可能的错误引发位点决定于引物序列组成与模板序列组成的相似性，相似性高则错误引发率高，错误引发的引发率一般不要高过100，如此可保证不出非目的产物的假带。

(7)引物二聚体及发夹结构的能量一般不要超过4.5，否则容易产生引物二聚体带而且会降低引物浓度从而导致PCR正常反应不能进行，与二聚体相关的一个参数是碱基的分布，3’端的连续GGG或CCC会导致错误引发。

(8)对引物的修饰。引物5'端对扩增特异性影响不大, 可在引物设计时加上限制酶位点、核糖 体结合位点、起始密码子、缺失或插入突变位点以及标记生物素、荧光素、地高辛等.通常应在5'端限制酶位点外再加1-2个保护碱基。(9)简并引物应选用简并程度低的密码子, 例如选用只有一种密码子的Met, 3'端应不存在简并性。否则可能由于产量低而看不见扩增产物。

一般PCR反应中的引物终浓度为0.2-1.0μmol/L。引物过多会产生错误引导或产生引物二聚体, 过低则降低产量。利用紫外分光光度计, 可精确计算引物浓度, 在1cm光程比色杯中,260nm下,引物浓度可按下式计算: X mol/L= OD260/ A(16000)+C(70000)+G(12000)+T(9600)X: 引物摩尔浓度,A、C、G、T: 引物中4种不同碱基个数。3 引物设计

现选取一段未知序列GGTTCCATCTGCCCGTCGGTACGGTAACAGGAAGCGGCTTGCTGCTTCGCTGACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAATGTCTGGGAAACTGCCTGATGGAGGGGGATAACTACTGGAAACGGTAGCTAATACCGCATAACGTCGCAAGACCAAAGAGGGGGACCTTCGGGCCTCTTGCCATCGGATGTGCCCAGATGGGATTAGCTAGTAGGTGGGGTAACGGCTCACCTAGGCGACGATCCCTAGCTGGTCTGAGAGGATGACCAGCCACACTGGAACTGAGACACGGTCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCCATGCCGCGTGTATGAAGAAGGCCTTCGGGTTGTAAAGTACTTTCAGCGGGGAGGAAGGGAGTAAAGTTAATACCTTTGCTCATTGACGTTACCCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTCCGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGGAGGGTGCAAGCGTTAATCGGAATTACTGGGCGTAAAGCGCACGCAGGCGGTTTGTTAAGTCAGATGTGAAATCCCCGGGCTCAACCTGGGAACTGCATCTGATACTGGCAAGCTTGAGTCTCGTAGAGGGGGGTAGAATTCCAGGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATCTGGAGGAATACCGGTGGCGAAGGCGGCCCCCTGGACGAAGACTGACGCTCAGGTGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGTCGACTTGGAGGTTGTGCCCTTGAGGCGTGGCTTCCGGAGCTAACGCGTTAAGTCGACCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGTTAAAACTCAAATGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGATGCAACGCGAGAACCTTACCTGGTCTTGACATCCACAGAACTTTTCAGAGATGAATATGTGCCTTCAGGAACTGTGAGACAGGTGCTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTTGTGAAATGTTGGGGTTAAGTTCCCGCAACGAGCGCAACCCTAATCCCTAG 并以此为例，简要说明引物设计的方法和思路。3．1 使用Primer 5 软件搜索引物（1）打开primer 5 软件，操作file→new→DNA sequence 打开下列窗口，将所选基因序列复制在输入框中(选择As),在此窗口内，序列也可以直接翻译成蛋白（如下图）。

图1 点击Primer进入引物设计窗口。

（2）在引物设计窗口可以连接到“引物搜索”、“引物编辑”以及“搜索结果”选项（如图2）。点击Search按钮，进入引物搜索框，选择“PCR primers”，“Pairs”，设定搜索区域和引物长度和产物长度。在Search Parameters里面，可以设定相应参数。一般若无特殊需要，参数选择默认即可，但产物长度可以适当变化，因为100～200bp的产物电泳跑得较散，所以可以选择300～500bp。（如图3）

图2

图3A

图3B（3）点击OK，软件即开始自动搜索引物，搜索完成后，会自动跳出结果窗口，搜索结果默认按照评分（Rating）排序，点击其中任一个搜索结果，可以在“引物窗口”中，显示出该引物的综合情况，包括上游引物和下游引物的序列和位置，引物的各种信息等。现选取搜索得到的引物1，为例进行说明。（如图 4）

图 4（4）对于引物的序列，可以简单查看一下，避免出现下列情况： 3’不要出现连续的3个碱基相连的情况，比如GGG或CCC，否则容易引起错配。此窗口中需要着重查看的包括：Tm应该在55～70 度之间，GC％应该在45％～55％间，上游引物和下游引物的Tm值最好不要相差太多，大概在2度以下较好。该窗口的最下面列出了两条引物的二级结构信息，包括，发卡，二聚体，引物间交叉二聚体和错误引发位置。若按钮显示为红色，表示存在该二级结构，点击该红色按钮，即可看到相应二级结构位置图示。最理想的引物，应该都不存在这些二级结构，即这几个按钮都显示为“None”为好。但有时很难找到各个条件都满足的引物，所以要求可以适当放宽，比如引物存在错配的话，可以就具体情况考察该错配的效率如何，是否会明显影响产物。

（5）在需要对引物进行修饰编辑时，如在5'端加入酶切位点，可点击Edit Primer，然后修改引物序列。（如图5）

图 5 对于引物具体详细的评价需要借助于Oligo 来完成，Oligo 自身虽然带有引物搜索功能，但其搜索功能弱于Primer5。现阶段对于引物设计而言一般使用primer 进行引物搜索，然后用Oligo进行引物分析。3.2 使用Oligo验证评估引物

（1）在 Oligo 软件界面，File 菜单下，选择Open，定位到目的cDNA 序列（在primer 中，该序列已经被保存为Seq 文件），会跳出来两个窗口，分别为Internal Stability（Delta G）窗口和Tm窗口。在Tm窗口中，点击最左下角的按钮，会出来引物定位对话框，输入候选的上游引物序列位置（Primer5 已经给出）即可，而引物长度可以通过点击Change－Current oligo length来改变。定位后，点击Tm窗口的Upper 按钮，确定上游引物，同样方法定位下游引物位置，点击Lower 按钮，确定下游引物。（如图6）

图 6A 上游引物确定

图 6B 下游引物

（2）在主窗口的Analyze中，第一项为Key info，点击Selected primers，会给出两条引物的概括性信息，其中包括引物的Tm值，此值Oligo是采用nearest neighbor method计算，会比Primer5 中引物的Tm值略高，此窗口中还给出引物的Delta G和3’端的Delta G.3’端的Delta G 过高，会在错配位点形成双链结构并引起DNA聚合反应，因此此项绝对值应该小一些，最好不要超过9。（如图7）

图 7（3）Analyze 中第二项为Duplex Formation，即二聚体形成分析，可以选择上游引物或下游引物，分析上游引物间二聚体形成情况和下游引物间的二聚体情况，还可以选择Upper/Lower，即上下游引物之间的二聚体形成情况。引物二聚体是影响PCR 反应异常的重要因素，因此应该避免设计的引物存在二聚体，至少也要使设计的引物形成的二聚体是不稳定的，即其Delta G 值应该偏低，一般不要使其超过4.5kcal/mol，结合碱基对不要超过3 个。Oligo此项的分析窗口中分别给出了3’端和整个引物的二聚体图示和Delta G 值。（如图8）

图8（4）Analyze中第三项为Hairpin Formation，即发夹结构分析。可以选择上游或者下游引物，同样，Delta G 值不要超过4.5kcal/mol，碱基对不要超过3 个。（如图9）

图 9 图中显示本文设计的引物中没有发夹结构存在。

（5）Analyze中第四项为Composition and Tm，会给出上游引物、下游引物和产物的各个碱基的组成比例和Tm 值。上下游引物的GC％需要控制在40％～60％，而且上下游引物之间的GC％ 不要相差太大。Tm值共有3 个，分别采用三种方法计算出来，包括nearest neighbor method、％GC method和2(A＋T)＋4(G＋C)method，最后一种应该是Primer5所采用的方法，Tm 值可以控制在50～70 度之间。（如图10A、B）

图 10 A

图 10 B（6）Analyze 中，最后一项是“PCR”，在此窗口中，是基于此对引物的PCR 反应Summary，并且给出了此反应的最佳退火温度，另外，提供了对于此对引物的简短评价。若该引物有不利于PCR反应的二级结构存在，并且Delta G 值偏大的话，Oligo在最后的评价中会注明，若没有注明此项，表明二级结构能值较小，基本可以接受。（如图11A、B、C）

图 11A

图11B

图11C 3.3 引物确定后，还可对上下游引物分别进行Blast 分析。本文设计的序列经过NCBI Blast 分析后确认该引物与大肠杆菌16s rRNA某序列有100%的相似性，与某些海洋成团泛菌16srRNA有较高的相似性。4 结论

本文通过使用primer、Oligo等软件对一段序列进行引物设计和引物分析，得到的引物经分析可知可用于该序列的PCR。经过Blast可知本引物可以作为PCR引物。