生化工程实验室分子生物学操作规范_生化试验操作规范
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生化工程实验室分子生物学操作规范
1.手套使用
原则上不论什么实验都应带手套操作，特别是： 1）无菌操作；
2）与RNA有关的所有操作；
3）重要克隆菌的挑单克隆、扩增、保存等；
4）与有毒试剂有关的所有操作，比如用EB染胶，用有机溶剂提取（在通风橱内操作）。2.移液枪及枪头使用 1）在合适量程范围内使用； 2）移液枪定期校对；
3）枪头必须插紧，防止脱落以及吸样体积不够； 4）不要水平放置带有枪头的枪； 5）使用后挂在枪架上，不可以乱放；
6）装枪头时必须戴手套，灭菌后50-70℃烘干后使用；
7）加样体积应为枪头最大体积的20-100%，低于该范围的用小一号的枪头。3.加样
1）加用任何试剂前要将试剂混合（除饱和酚或一些特别的有机试剂）；
2）加样的枪头应在试剂的中间表层吸收，防止枪头外壁带用过多试剂，改变加样试剂体积（除饱和酚外，一定要伸到饱和酚液的下部吸取）；
3）加酶时酶要放置在冰上，应注意体积准确，外壁不带，内壁吹打干净。注意用枪头从反应体系的管底吸上，反复吹打。4.混匀
1）除上述特殊试剂外，所有试剂在使用前后都要充分混匀；多数分子操作在加样后、反应前都要充分混匀；
2）0.2ml和0.5ml管30%体积以下可进行枪混匀和擦边混匀；
3）0.5-1.5ml管15-40%体积时，试管30%体积以下时可使用漩涡混匀器混匀； 4）0.5-1.5ml管30-70%体积，试管30-70%时可进行颠倒混匀。5.水浴锅
1）需提前10-30分钟调好温度，稳定后才能使用； 2）水位不可以低于水浴锅高度的50%，及时添水或换水； 3）使用合适的浮子； 4）使用完毕及时关闭电源。6.离心
1）离心如果需要预冷，应至少预冷15min； 2）要质量对称放置； 3）不合适的离心管应外套其他型号的离心管；
4）离心后如果要移动，应放在离心管架上移动，防止破坏液面； 5）短暂离心要在3000-8000rpm范围内，时间应短于30秒； 6）离心完毕应及时清理离心机。7.琼脂糖凝胶电泳 1）凝胶制作
配制凝胶的浓度据实验需要而变，一般在0．8％ ～2．0％之间，如果一次配制凝胶100 ml，没用完的凝胶可以再次融化，但随着融化次数的增加，水分丢失也越多，凝胶浓度则会越来越高，导致实验结果不稳定，补水办法：一是在容器上标记煮胶前的刻度，煮胶后补充相应的水分至原刻度；二是在煮胶前称重，煮胶后补充水至原重量。粗略一点的方法是通过多次较恒定的煮胶条件得出一个经验补水值。2）梳板的选用
一般每个制胶模具均配有多个齿型不同的梳板，梳齿宽厚，形成的点样孔容积较大，用于DNA 片段回收实验等；相反，梳齿窄而薄，形成的点样孔容积就较小，用于PCR产物、酶切产物鉴定等。梳板的选择主要是看上样量的多少而定，一般来说，上样量小时尽量选择薄的梳板制胶，此时电泳条带致密清晰，便于结果分析。另外，每次制胶时都要注意梳齿与底板的距离至少要1 mm，否则，拔梳板时易损坏凝胶孔底层，导致点样后样品渗漏。当然，点样孔的破坏还与拔梳板的时间和方法有关，一般凝胶需冷却30 min以上方可拔梳板，应急的情况下可以将成型的凝胶块放4℃ 冰箱中冷却15 min 左右，拔梳板的方法是将制胶槽放置在电泳槽中的电泳缓冲液中，然后垂直向上慢慢用力，因为有液体的润滑作用，梳板易拔出且不易损坏点样孔。3）点样
点样需加上样缓冲液，因为上样缓冲液中加了甘油或蔗糖增加密度，使样品沉入孔底；指示样品的迁移过程，上样缓冲液中一般加了两种指示剂，溴酚兰和二甲苯青(值得注意的是指示剂并非染色剂，DNA染色剂是溴化乙锭，而且要在紫外光的激发下才能看见桔红色荧光)。上样缓冲液储存液一般为6×(10×)，表示其浓度为工作浓度的六倍。使用时上样缓冲液应稀释到一倍浓度。点样方法是将移液器基本垂直点样孔，用另一只手帮助固定移液器下端，移液器枪头尖端进入点样孔即可将样品注入孔内，千万不可将尖插至孔底，并点上适合的DNA分子量标准，所谓适合是指样品DNA分子量大小应基本在DNA分子量标准范围之内。4）电泳 将电泳仪的正极与电泳槽的正极相连，负极与负极相连，核酸带负电荷，从负极向正极移动。电泳槽中电泳缓冲液与制胶用电泳缓冲液应相同，电泳缓冲液刚好没过凝胶1 mm 为好，电泳缓冲液太多则电流加大，凝胶发热。电泳时凝胶上所加电压一般不超过5 v/cm(指的是正负电极之间的距离，而不是凝胶的长度)，电泳时间一般为30-60 min，根据实验需要也可作适当调整，电压增高，电泳时间缩短，核酸条带相对来说不够整齐，不够清晰；相反，电压降低，电泳时间较长，核酸条带整齐清晰。另外，如果电泳后样品泳动很慢或者没泳动，请检查胶模两端的封口胶条是否已去掉。5）结果分析
较成功的电泳结果是分子量标准条带整齐清晰，样品条带也整齐清晰，如果条带模糊暗淡，单从琼脂糖凝胶电泳角度来说，可能的原因：EB见光易分解，母液配制时间过长或保存不当(一般4℃ 避光保存一年内有效)，或者终浓度没达到0.5 ug/ml；电泳槽中缓冲液使用次数过多，缓冲能力下降。特别是TAE缓冲液，一般用2-3次就要更换，TBE缓冲液则可使用10次左右。另外，溴化乙锭(EB)是一种中等强度诱变剂，操作过程中要戴手套，并将加有EB的染色液作好标记、妥善保存。实验室要严格区分污染区和非污染区，不要把污染区的物品拿到非污染区，碰过EB的手套要及时丢弃。
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