实验三 根茎叶显微观察与徒手切片_显微镜观察茎切片
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实验三 根茎叶显微观察与徒手切片
一、目的要求
1、学习植物的徒手切片技术
2、了解植物细胞的多样性，积累植物组织的知识，建立组织与功能协调一致的概念。
二、基本原理
根茎叶是植物的营养器官，都是由各种细胞和组织组成的。通过切片，我们可以在不同的切片中分别看到保护组织、机械组织、营养组织、输导组织、分生组织等。
徒手切片法是指手拿刀片把植物新鲜材料切成薄片，制成临时的水装片用于观察的植物组织制片技术之一。所作的切片通常不经染色或经简单染色，也可以通过脱水与染色制成永久制片。徒手切片的优点是简单、方便，不要复杂的设备，不经化学药物的处理，基本上保留了植物活体的状态。其操作要点是：在培养皿中放入清水。用左手大拇指、食指、中指等拿住材料，拇指略低于食指，且拇指要伸直呈反弯状态，中指等在下部稳定材料。材料切面要高于拇指，但略低于食指，双面刀片放在食指上，只有给它略加一个向下的力时，刀刃才能接触到材料。右手用食指和大拇指捏住双面刀片的一角，留出所有的刀刃部分，使刀刃近手指的一端首选接触到材料，然后让刀刃在材料上斜切下去，如果把材料切面看作是一个长方形的活，那么刀刃在材料上拉的是长方形的一条对角线，即从左前方向右后方拉切，注意不是垂直切向材料，一片，一片⋯⋯，轻松、快速地切，估计有满意的了，再一起放入盛有清水的培养皿中，挑选最薄的一片，装片观察。不要试图每一片都很薄，也不要追求切片形状的完整。其次，一定要注意，切片时不论是站着还是坐着，都要挺胸、放松地进行，是整个手臂在用力，也就是你在切片时，是肩关节在动，而不是肘关节，更不是腕关节。另外，切片时水是润滑剂，你的手指上、材料上、刀片上随时都应该有水。
三、实验材料、试剂与仪器设备
生物显微镜、载玻片、盖玻片、双面刀片、培养皿、滴管、吸水纸、毛笔，根茎叶结构的相关切片、鸢尾Iris tectorum的根、某种合适的双子叶植物的根、蚕豆Vicia faba的茎、蚕豆的叶、南瓜Cucurbita moschata茎、大叶黄杨 Euonymus japonicus的嫩茎、芹菜Apium graveoiens的叶柄、海桐Pittos-porum tobira或大叶黄杨的叶、小麦Triticum aestivum或其他禾本科小草的叶、萝卜的肉质直根，清水、I2-KI水溶液、0.1%番红染液
四、实验步骤(一)根的显微结构
1、根尖的内部结构
取玉米或洋葱根尖纵切永久制片，置于显微镜下，由根的最先端逐渐向上观察根尖的各区，注意各区细胞的特点。
①根冠 在根尖的最先端，由薄壁细胞组成，像一个套在分生区前面的帽子，在根冠的外侧，可见到某些正在脱落的细胞。
②分生区 根冠之内，紧接根冠的一段区域。由排列紧密的等径细胞组成，其细胞壁薄、核大、细胞质浓厚。细胞分裂能力强，常可以见到正在有丝分裂的细胞。
③伸长区 位于分生区的上方，从靠近分生区略微伸长的细胞到接近成熟区的长形细胞，细胞逐渐伸长并液泡化，向成熟区过渡。伸长区的细胞仍具有分裂的能力，边分裂，边分化，可以见到正在分裂的细胞，并有了初步的组织分化。在伸长区如何区分原表皮、基本分生组织和原形成层?在制片上常可见到宽大的成串长细胞，想想这些细胞将来分化成根的什么结构? ④成熟区（根毛区）位于伸长区上方，表面密生根毛的区域。在根毛区细胞分裂停止，分化成各种成熟组织时，可见到成熟的环纹、螺纹导管。注意根毛的起源以及结构特点。
2、单子叶植物根的结构
取鸢尾根2-5cm进行徒手横切(此根有一定的硬度，且较细，横切面一般低于1mm2，不适于初学切片，可以在芹菜叶柄和蚕豆茎切片之后再切此片)，并制成临时装片，不染色或用0.1％番红染色后在显微镜下观察，由外向内分为表皮、皮层和维管柱三部分： ①表皮 根的最外层细胞，排列整齐，有根毛。
②皮层 外皮层细胞1-2层，细胞小，排列整齐。在较老的根中，外皮层细胞壁增厚，木质化或栓质化。内皮层细胞幼时与一般双子叶植物结构差不多，有凯氏带加厚。随着发育的进行，内皮层细胞出现五面加厚，并栓质化，仅外切向面为薄的，在横切面上呈马蹄形。注意内皮层通道细胞的位置。
③维管柱 由中柱鞘、初生木质部和初生韧皮部组成。中柱鞘为紧贴内皮层的一层薄壁细胞。初生木质部和初生韧皮部相间排列，木质部脊数目较多，为多原型。维管柱中央是薄壁细胞组成的髓。
3、双子叶植物根的结构
⑴取蚕豆或向日葵幼根永久制片，也可以取其幼根的成熟区做徒手切片，置于显微镜下，由外向内观察双子叶植物根的初生结构。①表皮 幼根的最外层细胞，是径向扁平、排列整齐的一层细胞，外壁具有角质膜，有些细胞向外突起形成根毛。
②皮层 表皮之内的多层薄壁细胞。紧接表皮之下的是一层排列紧密的薄壁细胞叫外皮层，皮层的最内层细胞称为内皮层，也是一层排列紧密的细胞。在其径向壁和上、下壁上常有局部木质或栓质的加厚，彼此联结成环带状，这就是凯氏带。由于在径向壁上观察凯氏带仅为一个小点，亦称为凯氏点。想想外皮层的作用是什么?凯氏带在根中的作用是什么? ③维管柱 幼根的中央部分是维管柱，由中柱鞘、初生木质部和初生韧皮部构成。中柱鞘是中柱的最外层，紧接内皮层，是1～2层排列整齐而紧密的薄壁细胞，在根的进一步发育过程中有着重要作用。初生木质部位于维管柱的中央，呈星芒状，主要由导管和管胞组成，这些管状分子的孔径大小不同，观察不同孔径管状分子的分布规律，找出原生木质部和后生木质部的位置，想想根的初生木质部属于何种发育方式?观察木质部脊的数目想想双子叶植物常为几原型?初生韧皮部位于初生木质部两个辐射角之间，由筛管和伴胞构成。在初生木质部和初生韧皮部之间，有1～2层薄壁细胞，想想其来源如何?在蚕豆幼根的中心部分，有一群薄壁细胞，如何解释这个现象? ⑵取毛茛根横切永久制片置于显微镜下，同样从外向内观察，注意其与蚕豆或向日葵根的区别。特别注意内皮层细胞壁的加厚情况，其细胞壁为全面加厚。内皮层中不加厚的细胞是通道细胞，根的物质交换通过内皮层的通道细胞进入维管柱。
⑶形成层的发生 取蚕豆根横切永久制片，观察形成层的发生。首先在初生木质部和初生韧皮部之间出现形成层，呈圆弧型（观察其数目与木质部脊的数目是否一致，想想它们起源于什么细胞?），以后这些圆弧型的形成层向两侧扩展，同时在木质部脊的中柱鞘细胞，也恢复分裂的能力，两者互相连接形成一个波浪状的形成层环，其形状与木质部脊相似。形成层细胞进行切向分裂，在初生木质部和初生韧皮部之间的形成层细胞分裂较多，最终形成层环呈圆形。
⑷根的次生结构 取棉老根横切永久制片，在显微镜下由外向内进行观察，分别为周皮、次生韧皮部、形成层、次生木质部和初生木质部。(二)茎的显微结构
1、茎的顶端分生组织
取丁香或大叶黄杨茎尖纵切制片，置于显微镜下，从茎尖的最先端往后观察。顶端分生组织明显地分成原体与原套两部分，注意原体和原套的特点，以及识别茎尖的芽原基和叶原基。在原分生组织之下是已开始分化的初生分生组织，原表皮是最外面的一层细胞，原形成层为细胞质浓厚并纵向伸长的细胞，纵切面上分布在器官的两侧。基本分生组织细胞近乎等径，分布在器官的中央以及原表皮和原形成层之间。
2、茎的初生结构
⑴双子叶植物茎的初生结构
观察向日葵幼茎横切永久制片，由外向内分辨表皮、皮层和维管柱。①表皮 表皮细胞一层，排列紧密，外壁具有角质层。细胞具核，但缺少叶绿体。有些表皮细胞形成表皮毛（有单细胞毛和多细胞毛）。表皮细胞中常可见到两个较小的细胞和两个细胞之间的缝隙，这就是保卫细胞和气孔，气孔之下是孔下室。②皮层 表皮以内、维管柱以外的细胞。紧接表皮之下是几层厚角组织，细胞相对较小。其内是数层薄壁细胞，薄壁细胞中散布有小型的分泌腔。③维管柱 维管束在茎的横切面上排成一环，将皮层和髓分隔开。韧皮部在维管束外方，木质部在内方，两者之间是束中形成层（无限维管束）。髓在茎的中央，由薄壁组织构成，细胞排列疏松，有贮藏的功能，常可见到含有晶体或单宁的细胞。在维管束之间的薄壁组织是髓射线，连接皮层和髓，想想它的作用是什么?观察时注意比较茎的初生韧皮部和初生木质部的组成成分与发育方式、束中形成层来源与根有什么异同。
⑵单子叶植物茎的初生结构
取玉米或小麦茎横切永久制片进行观察。注意单子叶植物茎与双子叶植物茎的区别。①表皮 茎的最外层细胞，排列整齐，外壁具有较厚的角质膜。气孔的两边除了两个较小的保卫细胞外，还有两个稍大的副卫细胞。②维管束 玉米茎中维管束散生分布。靠近边缘部分维管束小、数日较多，在茎中部的维管束大，但数目较少。由于维管束的散生分布，因此没有皮层和髓的界限。仔细观察一个维管束，其外围有一圈厚壁细胞组成的维管束鞘，鞘内只有外方的初生韧皮部和内方的初生木质部，两者间没有形成层（有限维管束）。在初生韧皮部最外方的原生韧皮部有时被挤毁，失去了输导的功能，内侧的后生韧皮部由排列规则的筛管和伴胞组成。初生木质部由3-4个导管组成，在横切面上呈V形。V形的底部是原生木质部，由1-3个较小孔径的导管和薄壁细胞组成。常由于茎的伸长将导管拉破，在V形底部形成一个空腔（气腔或胞间道）。V形上半部两侧各有一个孔径较大的导管，是后生木质部，这两个大导管之间有一些管胞分布。在小麦茎中维管束呈两轮分布，外轮维管束小，分布在厚壁组织细胞中，与含有叶绿体的同化组织相间排列。内轮维管束大，分布在薄壁细胞中。维管束的结构与玉米相似。③基本组织 表皮和维管束之间的所有细胞称之为基本组织（因没有皮层和髓的界限）。玉米中，靠近表皮的数层细胞体积小，排列紧密，细胞壁增厚并木质化，是厚壁组织，称外皮层。维管束之间的细胞为薄壁细胞，细胞较大，排列疏松，有胞间隙。越靠近中央，细胞的个体越大。小麦中，靠近表皮有数层厚壁细胞，除有维管束分布外，还有与其相间排列的成群同化组织。厚壁细胞之内是较大的薄壁细胞。在小麦茎干的中央形成髓腔。
3、茎的次生结构
⑴双子叶植物草本茎的次生结构 取向日葵老茎横切永久制片，观察茎的次生结构。向日葵茎次生生长的变化主要表现在维管柱。在初生韧皮部的外方，出现成堆的厚壁细胞，为韧皮纤维。束中形成层细胞有3-5层，向外分裂形成韧皮部的各种细胞，向内分裂分化出本质部的细胞。还可观察到由部分束间形成层活动形成的小型维管束。
⑵双子叶植物木本茎的次生结构 取椴树（3-4年生）茎横切永久制片，由外向内依次观察双子叶植物木本茎的次生结构。
①表皮 基本脱落，留下部分残片。
②周皮 观察木栓层、木栓形成层和栓内层三部分所组成的周皮，并注意各层细胞特点。注意周皮是否有皮孔形成及皮孔的结构如何?试想木栓形成层的来源。
③皮层 在周皮和维管柱之间所保留的数层厚角组织和薄壁组织。
④韧皮部 主要是次生韧皮部。形状呈梯形，与喇叭口状的韧皮射线在圆周方向相间排列。韧皮纤维与韧皮部的其他成员沿半径方向相间排列。注意识别筛管、伴胞和韧皮薄壁细胞。初生韧皮部仅在最外侧留下韧皮纤维（亦称中柱鞘纤维）。
⑤形成层 理论上为一层细胞，但观察时可见到3～5层细胞，试想这是为什么? ⑥木质部 主要是次生木质部，在靠近髓的部分有几束初生木质部。注意年轮和年轮线，并分辨早材和晚材。
⑦髓 位于茎的中心，多为薄壁细胞，杂有少数石细胞。外围是一圈小型细胞，称环髓带。髓细胞除含有淀粉外，还包含有一些异细胞，在这些异细胞中，可见到簇晶、单宁和粘液。
⑧髓射线 内连髓外接皮层的薄壁细胞。在木质部为l～2列细胞，称之为木射线。在韧皮部细胞变大，并沿切向方向扩展呈喇叭口状，称之为韧皮射线。
⑨维管射线 短于髓射线。不能同时连接髓和皮层。与髓射线一样，在木质部叫木射线，在韧皮部叫韧皮射线。
⑶裸子植物茎的次生结构 裸子植物茎的次生结构与双子叶植物木本茎的结构相似，所不同的只是细胞的组成类型。它们的次生木质部形成了木材。其结构可通过横切面、径向纵切面和切向纵切面3个切面来观察各种细胞的特点。①横切面 可观察木材的年轮、早材和晚材、边材和心材的特征。在裸子植物（纵向系统主要由管胞组成）的横切面上见到的是管胞的横断面观，细胞的孔径比较均匀，细胞的组成比较简单。木射线展示的是长和宽。
②径向纵切面 可见到长形的管胞及壁上的具缘纹孔。木射线像一堵砖墙，展示的是长和高。
③切向纵切面 木射线展示的是高和宽，有时在较大的木射线中，可见到横向的树脂道。
4、徒手切片观察不同植物茎的结构
①蚕豆茎横切，主要可以观察茎表皮细胞，茎薄壁细胞及其细胞的结构、原生质流动等，茎中的形成层，维管束结构，等。
②南瓜茎横切或斜切，斜切可以看到螺纹导管。
③大叶黄杨的嫩茎横切，为双子叶木本植物茎的徒手切片代表。以上切片均可以不染色或用0.1%番红染色在显微镜下观察。(三)叶的显微结构
1叶片的显微结构
⑴取大叶黄杨或海桐叶作徒手切片，方法是：先将叶片中间叶脉两侧各留下2-3mm后切去，再切去剩下部分的远叶柄端，使切面呈近似的长方形，然后让叶正面贴向食指，材料、刀、手指均用清水湿润后，进行徒手切片，并做成临时装片。显微镜下观察，分清上下表皮、叶肉和叶脉三部分。
①表皮 一层排列整齐而又紧密的细胞。横切面上呈长方形，外壁较厚，其外有角质层。在表皮细胞中有成对、较小的细胞即保卫细胞，两个保卫细胞之间的缝隙是气孔。在表皮上还可以见到表皮毛。注意观察细胞中是否有叶绿体，以及上下表皮气孔的数目的差异。
②叶肉 注意观察栅栏组织和海绵组织的细胞特点，以及孔下室的分布位置。试想这些特点与环境及功能有什么关系? ③叶脉 叶肉中的维管组织，主脉较大，由主脉进行分支形成侧脉。主脉包埋在基本组织中，上方表皮下有厚角组织，下方基本组织中有厚壁细胞分布。叶脉维管束的木质部在近轴面，而韧皮部在远轴面。在较大叶脉的木质部与韧皮部之间有一层形成层细胞。侧脉维管束的组成趋于简单，木质部和韧皮部只有少数几个细胞，但一般具有薄壁细胞形成的维管束鞘。在切片中可以见到各种走向的叶脉，试想其原由。
⑵小麦叶的结构 用小麦叶进行徒手切片后观察。小麦叶的徒手切片要用萝卜条作为夹持物才可以。方法是用水果刀将萝卜切成约3×4×40(mm)的萝卜条，再在一端沿小长方形的长边方向的中央切一10-20mm 的缝，并将小麦叶的一段夹进去，捏紧，修切，作徒手切片。或 取小麦叶横切永久制片，置于显微镜下逐项观察。
①表皮 细胞一层，其外壁具有较厚的角质层。在表皮中有成对的保卫细胞，体积较小。在保卫细胞的两侧是略大一些的副卫细胞。上表皮中还有一些较大的细胞，常几个连在一起，在横切 面上略成扇形，叫泡状细胞，因其与叶片的卷曲有关，也被称为运动细胞。此外，还可见到表皮毛。
②叶肉 无栅栏组织和海绵组织的分化，细胞比较均一。叶肉细胞均富含叶绿体。若将叶肉细胞解离，可发现每个细胞的长壁呈有峰和谷之分的深的波浪状。
③叶脉 维管束与茎中一样都为有限维管束，木质部位于近轴面，而韧皮部在远轴面。维管束外有两层维管束鞘，外层细胞较大，壁薄，含有叶绿体；内层细胞小，壁厚。维管束的上下两侧具有厚壁细胞，一直延伸到表皮之下。试想这些厚壁细胞的作用是什么? ⑶玉米叶的结构 观察玉米叶的横切永久制片，并与小麦叶比较。玉米的维管束鞘只有一层大的薄壁细胞，含有大的叶绿体。维管束鞘与其外侧相邻的一圈叶肉细胞共同形成“花环状”结构，这是C4植物的结构特征。叶柄的显微结构
取芹菜叶柄，作徒手切片进行观察。主要可以见到表皮细胞、薄壁组织、厚角组织、维管束等。芹菜叶柄是最易进行徒手切片的实验材料之一。松针叶的显微结构
取松针叶横切永久制片，由外向内观察。
①表皮 细胞一层，排列紧密。细胞壁厚，胞腔小，外壁覆盖有厚的角质层。②下皮层 由1至多层厚壁细胞构成。气孔下陷到下皮层，由一对保卫细胞和一对副卫细胞组成。保卫细胞侧壁与下皮层细胞相连。副卫细胞在保卫细胞的上方，拱盖着保卫细胞，侧壁与表皮细胞相连。二者的胞壁都有不均匀的加厚，气孔下是下陷的孔下室。
③叶肉 位于下皮层以内，叶肉细胞的细胞壁内折，胞质内富含叶绿体。在叶肉组织中有树脂道分布。树脂道由两层细胞围成，外层是厚壁的鞘细胞，内层是薄壁的上皮细胞。树脂道的数目与分布的不同可作为种的鉴别特征。
④内皮层 叶肉细胞里面的一圈排列整齐的细胞，其径向壁上有类似凯氏带的加厚。⑤维管组织 位于针叶的中央，内皮层以内，有1～2个外韧维管束。木质部在近轴面，韧皮部在远轴面。木质部和韧皮部的细胞均成径向排列，木薄壁细胞与管胞各自成行，相间排列；筛管和韧皮薄壁细胞排列也是如此。韧皮部外侧有几个成堆分布的细胞，含有浓厚的细胞质，是蛋白细胞。内皮层和维管柱之间排列紧密的细胞是传输组织，包括常含有鞣质的生活薄壁细胞和壁稍厚略为木质化且壁上有具缘纹孔的管胞状细胞，前者占传输组织的大部分。
取雪松或黑松的叶作徒手切片观察。4 不同生态环境下生长的植物叶结构特点
⑴旱生植物夹竹桃叶横切永久制片
①表皮 细胞排列紧密，壁厚，外壁上有厚的角质层。下表皮有一部分细胞构成下陷的窝，窝内有表皮细胞形成的表皮毛，毛下有气孔分布。表皮细胞2～3层形成复表皮。
②叶肉 上、下表皮之内都有栅栏组织，栅栏组织由多层细胞构成，细胞排列非常紧密。海绵组织位于上、下栅栏组织之间，细胞层数较多，胞间隙不发达。在叶肉细胞中常含有簇晶。
③叶脉 维管束发达。主脉很大，为双韧维管束。⑵水生植物睡莲和眼子菜叶横切永久制片
①睡莲叶横切永久制片观察 上表皮有气孔。叶肉的栅栏组织和海绵组织的分化明显，栅栏组织在上方，细胞含有较多的叶绿体；而海绵组织在下方，有十分发达的气腔和一些分支石细胞分布。维管组织特别是木质部不发达。
②眼子菜叶横切永久制片观察 表皮无气孔，也没有角质层，但表皮细胞中含有叶绿体，试想这是为什么?叶肉细胞不发达，有1至几层细胞组成。在靠近主脉处，叶肉细胞形成大的气腔。叶脉的木质部导管和机械组织都不发达
五、注意事项
1本实验项目的实施需要学生具有一定的理论基础，计划学时为6学时。2 徒手切片技术非常简单和实用，一定要掌握其操作要领。
六、思考题
1绘鸢尾根的横切面图（四分之一部分），并注明各部分名称。
2绘玉米茎或小麦茎横切面轮廓图，详绘一个维管束，并注明各部分结构的名称。3 绘大叶黄杨(或海桐)叶横切面图或小麦叶的横切片图。
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