猪圆环病Ⅱ型及鉴别诊断技术研究进展_猪传染病鉴别诊断
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猪圆环病Ⅱ型及鉴别诊断技术研究进展
摘要：猪圆环病毒(porcine circovirus，PCV)属于圆环病毒科，该病毒有2个血清型：PCV1和PCV2。PCV1广泛存在于猪体内，无致病性；PCV2能直接或间接导致一系列猪的综合性疾病。如猪繁殖与呼吸道综合征病毒(PRRSV)，断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)，猪呼吸道疾病综合征(PRDC)和成年猪皮炎肾病综合征(PDNS)等，对养猪业危害严重。为了深入了解PCV2致病因素，建立快速鉴别诊断技术，综述了PCV2的猪圆环病毒病及其相关致病因素和目前应用诊断技术研究情况。为研究探讨PCV2的发生和诊断提供借鉴。关键词：猪圆环病Ⅱ型；诊断技术；致病基因
猪圆环病毒(PCV)是兽医学上已知动物病毒中最小的病毒，根据PCV的致病性、抗原性及核苷酸序列，将其分为PCV1和PCV2两个型，其中PCV1无致病性[1]，广泛存在于猪体内及猪源传代细胞系。PCV2则具有致病性，在临床上主要引起断奶仔猪多系统衰竭综合征。PCV对酸性环境(pH3)、氯仿或者高温(56℃和70℃)有抵抗作用。PCV在原代胎猪肾细胞、恒河猴肾细胞、BHK-21细胞上不生长，可在PK-15细胞中生长，但不引起细胞病变，且需将PCV盲传多代才能使病毒有效增殖。在接种PCV的PK-15细胞培养物中加入d-氨基葡萄糖，可促进PCV复制，使得感染PCV的细胞数量提高30％。感染PCV的细胞内含有许多胞浆内包涵体，少数感染细胞内含有核内包涵体。
PCV2属圆环病毒科(Circoviridae)，是最小的无囊膜单链环状DNA病毒，其单链环状DNA染色质由1759个碱基组成，有11个开放阅读框架，编码11种蛋白质，猪圆环病毒的抵抗力较强，不易被灭活，在外界环境中可长时间存活。由猪圆环病毒(PCV2)引起的猪圆环病，临床表现为体质下降、消瘦、皮肤发白、腹泻、呼吸困难和黄疸。
PCV2与大多数典型的猪病原传播不同，PCV2既可水平传播，也可垂直传播。Shibata等在近期研究中随机的发现，临床健康的猪体内含有PCV2[2]，说明PCV2可潜伏于健康猪群中，更出乎意料的是，科研工作者在怀孕母猪和哺乳期母猪的乳汁中检测出PCV2[3] 1 猪圆环病毒病及其相关性致病因素
1.1 相关的致病因子
PCV2的致病因子主要与免疫刺激、宿主的敏感性和PCV2分离株有关[4]。研究表明，免疫刺激可以激发PCV2从感染向疾病方向发展而出现PMWS的机能障碍特征，这可能是由PRRSV或猪细小病毒(PPV)激活了巨噬细胞，从而促进了PCV2的增殖。
在宿主敏感性研究中发现，长白猪较杜洛克和大白猪更容易出现与PCV2相关的疾病爆发，而皮特兰仔猪对与PCV2相关的疾病敏感性较低，且公猪的遗传品系对PCV2相关疾病发病情况有显著的影响。最新的证据则表明[5]，PCV2分离株在毒力上有一定的差异，但这种微小的分歧可能与病毒的地域来源有关，而与分离株的病毒毒力无关。
1.2 PCV2的协同感染疾病
PCV2的主要协同感染疾病在最初研究中倾向于猪肺炎支原体、PPV、PRRSV，可是随着研究的深入，发现了如猪皮炎与肾炎综合征、繁殖障碍、母猪流产和死亡综合征和PMWS等很多疾病可能都会协同PCV2感染。
充分的证据表明，由于PCV2和PPV在猪体内具有类似的靶细胞，而PPV提高免疫系统的功能导致了更严重的疾病，PCV2和PPV的双重感染会引发比单个感染PCV2更严重的临床症状和病变，在发生PCV2相关疾病PMWA的猪群中，PRRSV居最常见的协同感染因子名单之首，其检出率高达52％[6]。猪呼吸道综合征(PRDC)、增生和坏死性肺炎(PNP)、猪皮炎与肾炎综合征(PDNS)是发生在断奶、育成猪及成年猪群中的疾病，被认为是由多种病因共同感染所致，由于PCV2在这些共同感染疾病中普遍存在，其在这些疾病的共同感染中扮演了何种角色已普遍引起了人们的关注[7-8]，但PCV2与PRRS和PMWS直接相关的证据[9-10]，愈来愈明显。致病基因
PCV的基因组为单股、负链、环状DNA，病毒基因组以滚环模式(rolling circle model)进行复制。PCV2的复制起始区位于一个324 bp的片段上，其包含1个茎-环结构、保守的九核苷酸基序(AAGTATTAC)、3个六核苷酸重复序列(CGGCAG)和2个五核苷酸重复序列，Rep和Rep’的共表达是起始PCV2的复制所必须的，对PCV2的保守九核苷酸基序进行突变，从而影响病毒的复制过程，Rep和Rep’蛋白协同定位于同一个细胞的细胞核内，二者既可以形成同源复合物，也可以形成异源复合物。
据研究报道认为，猪圆环病的致病基因可能与ORFl-6这6个编码框编码的蛋白有关，其中ORFl为Rep基因，编码2种蛋白，负责PCV2的复制；ORF2为Cap基因，编码Cap蛋白，是PCV2病毒的唯一结构蛋白，可诱导产生中和抗体；ORF3编码的一种蛋白可以诱导宿主细胞凋亡[11-12]。
研究表明，ORF3诱导TNF-α达到较高水平可能与并发PPV和PMWS直接相关，ORF5诱导的IL-6可能与PDNS有关(PDNS也是IL-6明显增强)[13]，OFFR2基因表达的IL-10可能是感染猪逐渐发展成更严重的PMWS，而ORFl表达的Thl(IFN-γ)和Th2(IL-13)PMWS和PDNS有某种联系[14]。鉴别诊断技术
3.1 PCR方法
复合PCR技术具有单联PCR技术同样的优点，又能一次反应同时方便快捷的检测鉴别多种不同病原体。夏平安教授[15]等针对可引起猪免疫抑制病的重要病原PRRSV和PCV2建立了一种复合PCR检测方法，根据猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)美洲型标准株部分开放阅读框保守序列和PCV2基因保守序列，设计合成了2对特异引物，最终建立了可同时检测PRRSV和PCV2的复合PCR诊断方法。
冯志新等研究设计合成了一套引物和TaqMan探针，特异性扩增PCV2-ORF2基因，通过反应条件的优化，建立了快速定量检测PCV2的实时PCR方法。该方法具有较好的特异性和重复性，对PCV2 DNA检测的下限为1拷贝／uL，敏感性比常规PCR高106倍[16]。
Chae等报道了一种半槽式多重PCR，成功进行PCV1、PCV2和PPV的鉴别诊断，在98个精液样品中发现，有20个阳性的PCV和42个阳性PPV，与半槽式PCR诊断结果相同。当PCV或PPV在人为污染的精液样本中存在时，运用该技术分析发现：PCV和PPVDNA主要存在精
液和一小部分无精子中。实验数据表明，该方法具有较高的敏感性和特异性，可以很好地区别PCV或PPV在猪上的感染。
Kathleen运用实时PCR检测Rep基因(ORF1)在自然感染的猪群和实验室人工感染的猪群的肺、淋巴结等组织，可以检测到2.2×103～2．2×1010／mLPCV2拷贝数。同时，他们检测到在所有被PMWS感染的猪群中都存在Rep基因，即证明了存在PCV2的混合感染的可能性。
3.2 ELISA和ELISA试剂盒
林彦星等应用原核表达的PCV2衣壳(Cap)蛋白作为诊断抗原，初步建立了一种检测PCV2抗体的间接ELISA方法[17]。实验表明该方法具有较高的敏感性和特异性，适于大规模检测PCV2血清抗体的流行病学调查。秦承学等将PCV2 ORF1和ORF2基因分别插入杆状病毒和大肠杆菌表达系统，用亲和层析方法提纯获得重组衣壳(Cap)与复制(Rep)蛋白，用细胞融合技术获得2株Cap和Rep蛋白单克隆抗体，以重组Cap和Rep蛋白作为抗原，通过反应重要条件的优化，建立了间接ELISA方法，有较好的特异性和重复性，可用于PCV2抗体检测和疫苗免疫抗体鉴别诊断[18]。
研究人员研究对3种抗免疫球蛋白G的ELISA试剂盒检测抗PCV2a和PCV2b抗体，同时也检测了抗PCV2和PCV1抗体，55头3周龄的小猪随机分成7组，其中7头为阴性对照，8头接种PCV2a，8头接种PCV2b，8头接种PCV1，其余的24头接种不同厂家的3种疫苗，收集1周的血液样本，分别用3种试剂盒进行检测，反应数值都大于0.94，检测发现PCV2a和b抗体没有根本区别，没有检测出PCV1抗体，但1种试剂盒可鉴别出经疫苗B接种的猪体内的PCV2a或PCV2b抗体[19]。
3.3 竞争性酶联免疫吸附试验(C-ELISA)
Walker以分离的PCV2细胞培养物作为抗原，以PCV2特异性单克隆抗体作为竞争性反应物，C-ELISA敏感性和特异性达到99.58％和97.14％。McNelilly等建立了PCV特异性抗原捕获ELISA，其与定量病毒分离，可以区别PCV的临床和亚临床感染。
3.4 间接免疫荧光试验
间接免疫荧光技术常用于猪圆环病毒感染的血清学普查，其特点是快速、特异、敏感，是目前诊断PCV2常用的血清学方法。在用于抗体检测时，可将PCV2按种于96孔细胞培养板的PK-15细胞上，培养一段时间后，经丙酮固定干燥后即可。此方法不仅可以用于检测抗体，而且可以用已知PCV特异性抗体检测抗原，主要用于PCV的分离鉴定及猪源细胞PCV污染情况的普查，为疾病诊断和净化猪源细胞提供了有效手段。
3.5 免疫金标检测
浙江大学发明公开了一种猪圆环病毒2型(PCV2)抗原或抗体检测试纸条。检测试纸条既可以猪圆环病毒2型抗原也可以检测血清中的PCV抗体，检测试剂条操作简单，易于大范围推广应用，具有广阔的市场前景和较大的经济、社会效益。
3.6 环介导等温扩增技术
环介导等温扩增技术(Loop-mediated isothermal amplification，LAMP)是一种新的具有明显优势的扩增技术，能够在63℃～65℃等温条件下扩增特异的DNA序列，在30～60min可以得到肉眼可见的结果，该技术在禽流感的快速诊断中已成功运用。据研究数据统计分析表明，此技术的敏感性高于PCR，同时，在检测PCV1，PPV，PRV时无交叉反应，特异性较高，能够完成对PCV2的快速检测和定性分析，为PCV2的诊断提供了一种快速敏感的检测方法。
3.7 基因芯片技术
基因芯片(gene chip)的原型是80年代中期提出的，工作原理是应用已知核酸序列作为探针与互补的靶核苷酸序列杂交，通过随后的信号检测进行定性与定量分析。基因芯片是在一微小的基片(硅片、玻片、塑料片等)表面集成了大量的分子识别探针，能够在同一时间内平行分析成千上万的基因，进行大信息量的筛选与检测分析。基因芯片技术已经成功地应用于禽流感和口蹄疫等重大疾病的快速诊断及分型和定型，但在PCV2混合感染的相关疾病的快速诊断和鉴定上还没见报道。可以预见，在不久的未来可能会出现基因芯片技术在PCV2引起的相关疾病上的应用。
3.8 原位杂交(ISH)技术
ISH具有高度敏感性，在国内外已经建立了多种方法。应用ISH既可以对PCV1和PCV2进行分型，又可以检测PCV与其他病毒的混合感染。刘方娜等根据GenBank中已发表的猪圆环病毒2型(PCV2)基因序列，在ORF2内设计l对特异性引物，利用PCR反应扩增出371 bp的核酸片段，回收并纯化PCR产物，用地高辛标记，建立了地高辛标记核酸探针诊断PCV2的方法[20]。该探针与8个PCV2重组菌的核酸抽提物均能发生特异性杂交，而与对照组猪圆环病毒I型(PCVI)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪细小病毒(PPV)、猪伪狂犬病病毒(PRV)的核酸杂交均为阴性；对PCV2 DNA的最低检测量为lOpg。结论与讨论
PCV2与一系列猪的综合感染相关，这些疾病包括PMWS，PNP，PDNS，PRDC。很显然，这些疾病的发生与发展，至少与PCV2损毁猪的免疫系统有关，比如，PMWS发展是由于免疫系统异常和免疫抑制有关。显微镜观察发现，PCV2在淋巴组织的淋巴细胞、组织细胞和巨细胞广泛存在，导致体液免疫和细胞免疫失败。同时，由于PCV2分离株在毒力和地理分布上相差较大，这就意味着它的病原学意义有相当高的研究价值。
有文献报道，PCV2可以感染牛，接种PCV2完全可以致死8周龄的小鼠，这是否意味感染别的动物还需要进行很多的调查研究。目前，PCV2的研究倾向与动物解剖，然后进行分型和鉴定，这明显不利于动物安全生产、疾病的控制和人类自生安全。PCR技术有存在假阳性的问题，ELISA虽然特异性和敏感性较高，但它所用时间较长，在快速诊断方面显然不足，LAMP技术花费时间较少，敏感性和特异性也较高，但他是一个相对较新的技术，还需要更多的临床验证，基因芯片技术已经成功地应用于禽流感、口蹄疫和人类重大疾病的快速诊断及分型和定型，但在PCV2诊断和鉴定上还没见报道。如何与PCV2相关疾病的混合感染中进行快速的分型和定型鉴定，如何加强传统诊断技术的完善，以及加大对PCV2分子致病特性的研究力度，是科学工作者努力探索的问题；从而建立快速、敏感、准确的分子诊断技术和诊断方法，定期检测和预测即将流行的毒株，不断提高传统技术敏感度和特异性，同时不断推广和完善新方法、新技术，为早期、快速、特异、敏感地鉴别诊断此病毒，为有效地防控PCV2暴发与蔓延具有重大的理论意义和现实意义，控制PCV2对全世界养殖业及公共卫生构成的巨大威胁。
参考文献
[1]Tischer I，Rasch R，Tochtermann G．characterization of papovavirus and picornavirus-like particles in permanent pig kidney cell lines[J]．Zentralbl Bakteriol，1974，226：153—167．
[2]Shibata，Y Okuda，K Kitajima and T Asai．Shedding of porcine circovirus into colostrum of sows[J]．J Vet Med B，2006，53；278-280．
[3]Y Ha，K K Ahn，B．Kim，et al.Evidence of shedding of porcine circovirus type 2 in milk from experimentally infected sows[J]．Res Vet Sci，2009，86(01);108—110．
[4]Tara Oprienig．PCVD-From pathogenesis to protection：Part5．PCVD and aociated diseases[J]．Pig progre，2008，24：24-26．
[5]Oprienig T．Ramamoorthy S，Madson DM，et a1．Differences in virulence among porcine circovirus type 2 isolates areunrelated to cluster type 2a or 2b and prior infection provides heterologous protection．J Gen Virol，2008，89(10)：2482—
2491．
[6]Waddilove A E J，Marco E．Aeing serotherapeutic controlof PMWSin the field[C]．Proceedings of the international pigveterinary society congre．Ames Iowa USA．2002，34：229-305．
[7]Pogranichniy R M，Yoon K J，Yaeger M，et al.Efficacy ofexperi mental inactivated PCV2 vaccines for
preventing PMWSin CDCD pigs[C]．Proceedings of the 35th annual meeting of the american aociation of swine veterinarians．Des Moineslowa．2004：443-444．
[8]Australian Pork Ltd Australia remais free of PMWS and disease prevention to remain focus of Australian pork industry [J]．Pig News and Information，2006，27(1)：8-9．
[9]John C．S．Harding．The clinical expreion and emergence of porcine circovirus 2[J]．Vet Microbiol，2004，98(2)：131—135．
[10] Danja D．Wiederkehra，Titus Sydlera，A new emerging genotype subgroup within PCV-2b dominates the PMWS epizootyin Switzerland[J]．Vet Microbiol，2008，5：102—111．
[11]M Fort，A Olvera，M Sibila，et a1．Detection of neutralizing antibodies in postweaning multisystemic wasting syndrome(PMWS)-affected and non-PMWS-affected pigs[J]．Vet Microbiol，2007，125：244-255．
[12]J Liu，Y Zhu，I Chen，J．et a1．The ORF3 protein of porcine circovirus type 2 interacts with porcine ubiquitin E3 ligase Pirh2 and facilitates p53 expreion in viral infection[J]．J Virol，2007，123：203-209．
[13]L S Stevenson，K McCullough，I Vincent，et a1．Cytokine and C-reactive protein profiles induced by porcine circovirus type 2 experimental infection in 3-week-old piglets[J]．Viral Immunol，2006，19：189-195．
[14]Dong Jun An，Dae Sub Song，Bong Kyun Park．Systemic cytokine profiles of mice vaccinated with naked DNAs encoding six open reading frame antigens of porcine circovirus type 2(PCV2)[J]．Res Vet Sci，2008，85(03)：503—509．
[15]周海范，夏平安，崔保安，等.猪繁殖与呼吸综合征、猪圆环病复合PCR诊断方法的建立及应用[J]．河南农业科学.2007(1)：106-109．
[16]冯志新，姜平，王先炜，等．猪圆环病毒2型TaqMan实时PCR检测方法的建立[J]．中国病毒学，2006，21(4)：371—374．
[17]林彦星，孙彦伟，刘镇明，等．应用原核表达的猪圆环病毒2型Cap蛋白建立一种间接ELISA诊断方法
[J]．中国预防兽医学报，2007，29(3)：217-221．
[18]秦承学，姜平，王先炜，等．表达猪圆环病毒2型Rep蛋白的重组杆状病毒的构建与鉴定[J]．畜牧与兽医，2007，39(10)：125．
[19]Patterson A R.Johnson J，Ramamoorthy S，et a1．Comparison of three enzyme-linked immunosorbent aays to detect Porcine circovirus-2(PCV-2)-specific antibodies after vaccination or inoculation of pigs with distinct PCV-l or PCV一2 isolates[J]．J Vet Diagn Invest，2008，20(6)；744—751．
[20]刘方娜，刁有祥，王妮，等．猪圆环病毒2型地高辛标记探针检测方法的建立与应用[J]．中国兽医学报，2008，28(7)：771-774．
