大学生创新实验色法比较不同基源钩藤总生物碱含量结题报告_钩藤总生物碱

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比色法比较不同基源钩藤总生物碱含量-结题报告

申请人：刘伟 指导教师：刘莉

第一部分：[课题提出的背景及意义]

钩藤，始载于《名医别录》（汉末），原名钓藤，列为下品。因其性味甘、凉，归肝、心包经，具有清热平肝，息风定惊之功效：主要用于头痛眩晕、惊痫抽搐等症。现代研究表明，钩藤的主要有效成分是生物碱；其中钩藤总生物碱又有降压作用。根据药典有关生物碱含量测定的方法为滴定法，文献中多采用酸性染料比色法，但哪种方法更灵敏、更准确、重现性更好文献中并未报道。本实验以钩藤提取物作为样品，对这两种方法用于测定钩藤总生物碱含量的比较研究，本研究将为含生物碱的中药测定方法的选择提供实验依据。

第二部分：[研究的主要内容和目标] 钩藤总生物碱含量测定方法的比较

第三部分：[研究方法] 采用酸化乙醇提取的方法提取获得总生物碱粗品，比较滴定法与酸性染料比色法测定总生物碱含量。

第四部分：[研究工作的组织与实施]

刘莉老师作为指导，本研究小组讨论提出研究方案，通过预实验确定了钩藤总生物碱粗品的含量，经过修改完善，确定研究方案。

研究的阶段分为实验准备阶段、钩藤总生物碱提取阶段、不同测定方法的比较这三个步骤。

第五部分：[研究结论与成果]

实验结果表明酸性染料比色法测定钩藤总生物碱含量更准确、更稳定，建议钩藤生物碱含量测定采用酸性染料比色法。

第六部分：[质量与效果分析] 对研究结果进行分析：通过合理的实验设计，正确的实验操作，根据钩藤生物碱的提取规律，采用酸化乙醇溶剂提取法提取生物碱，并对滴定法与酸性染料比色法进行含量测定比较，基本确定酸性染料比色法法用于钩藤生物碱含量测定更优。这些实验方法都是常用的提取与测定方法，实验设计合理，基本完成研究目标。为生物碱含量测定提供了基本实验依据。

研究的自我评价：钩藤作为现在临床常用中药特别是现代药理实验证实，钩藤具有显著的降压作用，研究证明有效成分为生物碱，但对生物碱含量测定还缺乏灵敏、准确的确却方法。本实验就是探究确定酸性染料比色法比滴定法在测定钩藤生物碱更稳定准确。

收获与体会：通过这个研究对含生物碱成分的测定方法有了更深的了解，为以后其他中药含生物碱成分含量测定方法选择提供参考。

第七部分：[进一步要研究的问题]

本实验只针对钩藤生物碱含量测定做了方法学比较，进而推广到类似生物碱含量测定。是否有特殊还需进一步研究。

附：实验报告

一 实验目的：

钩藤总生物碱含量测定方法的比较

二 实验原理：

利用钩藤生物碱可以用酸化乙醇提取的方法提取获得总生物碱干膏，对干膏进行生物碱含量测定。药典测定生物碱常用滴定法，而文献常见用酸性染料比色法测定生物碱含量。本实验采用这两种测定方法分别对同一钩藤生物碱干膏进行生物碱含量测定以及方法学考察，从而比较两种方法哪一种更灵敏、更准确。三 实验仪器与试剂

UV2000紫外分光光度计、碱式滴定管、烧杯、三角锥形瓶、容量瓶、蒸发皿、烧瓶、分液漏斗、冷凝管、分析天平、移液管、滴定管；

钩藤药材、钩藤碱标准品、溴甲酚绿、亚甲基红-溴甲酚绿混合指示剂、无水乙醇、乙醚、盐酸、乙醇、氨水、PH试纸、无水硫酸钠、硫酸、氢氧化钠 四 实验步骤：

（一）钩藤总生物碱的提取

取钩藤药材200g粉碎成粗粉用0.1%盐酸酸化的80%乙醇1400ml浸泡24小时，抽滤，药渣再用0.1%盐酸酸化的80%乙醇700ml在60℃水浴回流2h，抽滤，重复一次，合并滤液，65℃减压回收乙醇，得酸水浓缩液(1：1)200ml，抽滤得浓滤液，转移到分液漏斗中加氨水调ph9~10，用乙醚萃取3次，合并乙醚层，回收乙醚得干燥钩藤总碱样品。

（二）钩藤生物碱含量的测定

1、样品生物碱溶液配制与生物碱溶液配制

精密称取样品钩藤总碱干膏200 mg加无水乙醇使溶解定容到250ml容量瓶,得样品①

取样品①25ml用无水乙醇定容到250ml得样品②；

精密称取标准钩藤碱5.2mg加无水乙醇使其溶解定容到50ml容量瓶，得标准品①

取标准品① 10ml用无水乙醇定容到100ml得标准品②

2、两种测定方法测定生物碱含量

2.1.、滴定法（药典）

取样品①5ml至三角锥形瓶中，精确加入0．0116 mol／L硫酸标准液25 mL，加入甲基红一溴甲酚绿混合指示剂2或3滴，以0．0232 mol／L 氢氧化钠溶液滴定，由红色至绿色为终点。重复做五组，记录使用氢氧化钠用量。2.2、酸性染料比色法 2.2.1标准曲线制备

精密量取钩藤碱标准品②溶液1.0，2.0,5.0，10.0,15.0,18.0，挥干无水乙醇，残渣加入XX缓冲液5.0ml，然后加入溴甲酚绿酸性染料溶液5.0ml加入乙醚4ml，摇摆2min，分出下层，反复萃取三次，合并乙醚萃取液加0.4g无水硫酸钠脱水。分别在UV2000型紫外可见光光度计在412nm时测定吸光度，以吸光度A为纵坐标，以钩藤碱量为横坐标作标准曲线，得回归方程A=0.004297M-0.2695（r=0.9901）线性范围为10.4ug--195.2ug。2.2.2样品测定

精密量取钩藤总碱样品②5.0ml按上法测得吸光度，计算的含量。

（三）方法学考察 3.1 滴定法

3．1.1 精密度实验 精密量取钩藤碱样品①溶液3．0 ml 按2..1法操作测得含量，平行测定6次，含量得RSD=6.33%(n=6)，表明仪器精密度符合要求。3．1.2 稳定性实验 精密取样品液①5ml，每隔30min测一次含量，结果4 h内含量没变化。结果，RSD= 6.81%(n=7)。

3.1.3 加样回收率实验 取钩藤碱标准品液①10ml与样品液①5．0 ml混合，3份，挥干无水乙醇，按2．1法操作，测定含量。得空白回收率平均值 79.95%，RSD=3.33%。3．1.4 重复性实验 精密称取钩藤样品液①5.0ml按2.1法操作，测定含量，结果平均含量为0.388%，RSD=6.81%

3.2 酸性染料比色法

3．2.1 精密度实验 精密量取钩藤碱样品②溶液3．0 ml 按2.2.1法操作测得吸光度，平行测定6次，吸收值得RSD=0.117%，表明仪器精密度符合要求。3．2.2 稳定性实验 取精密度试验样品液②，每隔30min测一次吸收值，结果4 h内吸收值稳定。结果，RSD=(n=7)3.2.3 加样回收率实验 取钩藤碱标准品液②与样品液各5．0 ml混合，6份，挥干无水乙醇，按2．2．1法操作，测定液分别在412 nm测定吸光度。得空白回收率平均值 97.19%，RSD= 1.34% 3．2.4 重复性实验 精密称取钩藤样品液②5.0ml按2．2.1法操作，测定液分别在412 nm测定吸光度，结果平均含量为0.193%，RSD=0.017% 五 实验结果与讨论

上述实验结果显示，对于同一样品，采用滴定法和酸性染料比色法对钩藤生物碱含量的测定结果相差明显（近两倍），从测量结果上来看酸性染料比色法要比滴定法准确性、可靠性要高。滴定法不仅灵敏性低，测量时需要的样品量大，而且滴定终点颜色确定稳定性低，实验结果容易受个人因素影响。酸性染料比色法样品需要量小，稳定性、重现性都非常好。因此建议，钩藤生物碱含量测定用酸性染料比色法较为适宜。

点评：

1、各部分有点简单。

2、实验数据列表分析。

3、缺实验的讨论、缺乏参考文献。

4、完成论文并投稿。