实验四 PCR扩增基因特异片段_实验四pcr基因扩增

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实验四

PCR扩增基因特异片段

一、实验目的1、学会PCR仪的使用方法。

2、掌握PCR反应的实验技术。

二、实验原理

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction）简称PCR。聚合酶链式反应（PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究，还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方．聚合酶链式反应又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。

GLBI蛋白是玉米胚中含量最丰富的蛋白质之一，其编码基因glb1位于第一染色体长臂，基因表达仅限于种子组织。该蛋白对于幼苗生长与存活并非必需。本实验扩增glb1基因部分序列，全长1200bp左右。

真核生物基因组中编码核糖体的基因包括28S rDNA、5S rDNA、18S rDNA和5.8S rDNA 4 种,它们在染色体上头尾相连、串联排列,相互之间由间隔区分隔。其中18S、5.8S和28S rDNA基因组成一个转录单元，三者高度保守,适合于较高等级水平的生物群体间的系统分析, 其间的间隔区为内转录间隔区(Internal Transcribed Spacer, ITS)，本实验扩增榨菜黑斑病ITS序列，序列全长500kb左右。

三、实验仪器及药品耗材

1、主要仪器：移液器、振荡器、PCR仪、电子天平、量筒、微波炉、电泳仪、水平电泳槽和凝胶成像系统等。

2、主要药品及耗材：一次性手套、PCR板、移液器吸头、无菌水、2×PCR 混合酶（Taq DNA Polymerase、PCR Buffer、Mg2+、dNTPs及PCR稳定剂和增强剂组成的混合液）、液体石蜡、琼脂糖、0.5×TBE缓冲液、Goldview染料、DNA Marker 2000和溴酚蓝等。

四、实验步骤

（一）PCR扩增玉米目的基因glb11、在PCR管中配制25ul反应体系 双蒸水 8.5ul 2×PCR 混合酶

12.5ul 正向引物ul 反向引物 1 ul DNA 2 ul 液体石蜡 20 ul2、按一下程序进行扩增 94℃预变性5 min，1个循环；

94℃变性1 min，64℃退火1 min，72℃延伸2 min，共设35个循环； 72℃延伸10 min； 4℃保存

(二)琼脂糖凝胶电泳检测PCR结果

配制1%琼脂糖凝胶，在25ul PCR扩增产物加1ul溴酚蓝，200伏，200毫安，电泳并观察结果。

五、作业

绘画出PCR扩增电泳图，标明DNA Marker 位置及检测PCR产物位置，并根据DNA Marker位置及亮度估算PCR扩增产物的大小及浓度。