分子标记技术在中药分类资源保护中的应用进展_中药资源保护

分子标记技术在中药分类资源保护中的应用进展由刀豆文库小编整理，希望给你工作、学习、生活带来方便，猜你可能喜欢“中药资源保护”。

摘要： 分子标记技术一般是指研究核酸及蛋白质等携带遗传信息的大分子特征的技术，分子标记可分为DNA分子标记和蛋白质分子标记。分子标记技术引入中药领域后被广泛地应用于分类、鉴别和保护等各个层面，受到越来越多的重视。本文将重点介绍在中药分类和资源保护方面的应用。

关键词： 分子标记技术 中药分类 资源保护

Molecular markers in Chinese medicine claification resources

protection application progre Abstrac: Molecular markers usually refers to study nucleic acids and proteins such carries the genetic information macromolecules characteristics of technology, molecular markers can be divided into DNA molecular markers and protein molecular markers.Molecular marker technology into the Chinese medicine after the field is widely applied in the claification, identification and protection and at all levels, by more and more attention.This article will mainly introduced in Chinese traditional medicine claification and resources protection applications.Key words: Molecule Marker Technology

TCM claification

Resources protection

引言

DNA分子标记是随着核酸分子技术的发展而发展起来的,已被应用于生命科学的各个领域，特别是在系统进化、保育遗传学、品种鉴定及良种选育、遗传图谱构建、基因定位等方面得到了广泛应用。根据DNA 分子标记所采用的核心技术大体上可分为三类：一是以分子杂交为基础的DNA指纹技术；二是以PCR为基础的DNA指纹技术；三是DNA序列标记技术。DNA分子标记

1.1

基于分子杂交的DNA指纹技术基于分子杂交的DNA指纹技术可分为RFLP,SSR等技术，这些技术的实验过程一般要包括限制性酶切、Southern印记、探针标记、分子杂交等繁琐的实验步骤，且只能检测出探针长度范围内切酶识别位点的变异，多态性检出效率低，同时要求的DNA量比较大，因而限制了其在实际中的应用。本类技术在植物系统与进化研究中有很多成功的例子，但在中药领域目前应用得较少，这里不做重点介绍。

1.2

基于PCR基础的DNA指纹技术基于PCR的指纹技术近年来层出不穷，它们各有其优缺点和适用范围。这里根据各技术在中药领域中应用的潜力及普遍性等方面重点介绍以下几种：随机扩增长度多态性DNA（RAPD）、基于PCR的简单重复序列（PCR-SSR）、扩增片段长度多态性（AFLP）、基于PCR的限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）、直接扩展增长度多态性（DALP）。

1.2.1 RAPDRAPD是以10碱基的任意序列寡核苷酸片段为引物，在未知序列基因组DNA上进行随机扩增以研究样本间遗传差异的指纹技术，是当今在中药研究领域中应用的最广的分子标记技术，如分类和遗传关系分析、遗传多样性评价、资源保护等，起到了非常重要的作用。

遗传关系分析：RAPD分析和等位酶标记都被广泛地用来研究物种的遗传多样性，但能检测到比等位酶高的多样性信息。邵爱娟等［1］利用RAPD对栽培人参不同品系之间的遗传多样性进行研究，从分子水平证明了根据表征性状对人参栽培类群进行划分是可行的。郭宝林等［2］利用RAPD技术探讨了中药厚朴种内关系和道地性问题，并将所得结果与形态学及指标成分相联系，最终认为厚朴应分为3个地理综，道地性主要

分化，并发现一个川明参特有的遗传标记，因此支持将明党参与川明参作为两个种处理。周延清等［11］在PCR-ISSR反应体系中加入2%去离子甲酰胺降低模糊背景，仅用一个引物就鉴别了实验所用的10个怀地黄品种。葛永奇等［12］对江苏泰兴、美国纽约栽培的银杏群体和中国3个可能为野生的银杏自然群体（浙江天目山、贵州务川、湖北大洪山区）的遗传多样性水平和群体遗传结构进行了研究后发现：群体遗传多样性以贵州务川最高，美国纽约的栽培群体最低；在聚类时，务川群体与天目山群体首先聚成一类，美国纽约群体则与湖北大洪山群体具有较近的亲缘关系，并结合遗传结构的分析和生态学研究结果，给出了银杏保护的策略。彭云滔等［13］研究了采自广西和广东罗汉果野生居群的样品，认为罗汉果各居群点的遗传多样性存在较大的差异，且居群间产生了较大的遗传分化，因此在进行保护重点地区种质资源时也要注意其它地区野生罗汉果的保护和利用。杨淑达等［14］在对我国西南地区特有植物滇牡丹进行ISSR分析时指出，该物种遗传多样性水平较高，居群间分化较大，造成其濒危的主要原因应为生境破坏和滥采滥挖。

1.2.4 AFLPAFLP基本原理是对基因组DNA进行限制性酶切，使用双链人工接头与基因组DNA的酶切片段相结合作为扩增的模板，接头及相邻的几个碱基序列做为引物的结合位点进行PCR扩增得到多态的DNA指纹，常常用于种质资源评估、遗传关系等方面的研究中。虞泓等［15］对石斛属内石斛组4个种和一个未知类群种进行基因组DNA多态性分析，发现5种石斛单独聚类，同时两个金钗石斛居群在种下分别聚类，为进行石斛的分类鉴别提供了分子生物学基础。王晓梅等［16］检测了雌雄银杏基于DNA的差异，筛选出与银杏性别有关的分子标记，其中3个引物组合各提供了1个与雌性相关的标记，这为寻找性别特异的探针或PCR引物，用于银杏性别鉴定奠定了基础。周世良等［17］利用野生屏边三七作对照，采用4个引物组合对3个种植场的三七进行分析，并对比ITS测序结果，认为三七变成栽培作物后，有比较严重的遗传多样性的丧失，但仍存在着变异，对保存了相对较高遗传多样性的居群应重点保护，同时考虑到居群间仍存在较大的遗传变异，其相邻居群也应予以保护。

1.2.5

PCR-RFLPPCR-RFLP是对PCR扩增的DNA片段进行限制性酶切位点分析。韩国Um Jae Young等［18］应用RAPD和PCR-RFLP技术对4个韩国与中国产人参进行了检测分析，结果发现韩国产人参DNA指纹具有极大的差异性，可以互相区别。

1.2.6 DALP直接扩增长度多态性（DALP）是由 Desmarais等

［19］

开发的，是基于生物体中普遍存在大量M13序列，利用经过修饰或未经修饰的M13通用引物对进行PCR扩增来研究基因组DNA长度多态性的一种技术。DALP一般使用的引物（20～27 mer）较长，可以适合较为严格的扩增条件，包括相对高的退火温度和低氯化镁浓度，因此可以得到重复性好的结果。在引物扩增时可采用两种策略以适应不同的实验要求：一种是在进行扩增时每个样本需要通过同一对引物组合进行两次独立的PCR扩增反应（但每次只将组合对中的一个引物标记），在分析时可将两次结果在同一张图谱上对比，只分析那些由两条引物扩增的条带，进一步减少由同一引物扩增引起的非特异性干扰；另一种是不经引物标记，只做一次扩增，直接将扩增产物进行检测，比较不同样本DNA多态性的差异，以缩短实验周期、降低实验成本。DALP现已经成功用于检测不同类群生物（如病毒、脊椎动物和无脊椎动物）的亲缘关系和多态性的研究［20～22］，但目前在中药分类与保护领域中，应用的还比较少，如：夏惠茵等［23］在利用DALP鉴定人参与西洋参时，降低了选择性引物/反向引物的比率来解决反向引物亲和性的问题并使用50～55℃以减少背景干扰，建立了快速的PCR鉴别方法，鉴别了人参与西洋参；李永谊等［24］通过对PCR反应条件中主要参数的实验和比较分析，发现所有样品都可以得到5个引物的9条谱带，因此建立了可直接用于红景天药材品种鉴定的DALP反应体系。相信此项技术将越来越广泛地应用于中药分类与资源保护的各个层面。

1.3 DNA序列标记技术DNA序列标记技术是直接测定生物体中的特定序列并进行遗传差异分析的一种技术。目前常用的序列主要有核基因组的rRNA，ITS等；植物叶绿体基因组的rbc族基因、trnK及其内含子matK 基因、rpoC 基因、rpl基因等；动物线粒体基因组cyt-b 基因、12S rRNA等。高建平等［25］得到不同产地不同居群华中五

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