细胞培养在分子生物学中的应用_分子生物学在的应用

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细胞培养在分子生物学中的应用

随着社会的进步，科学的发展，生物技术已经得到了很大的改进，下面我就从心肌细胞培养，植物体细胞培养再生技术体系，马立克氏病病毒分子生物学诊断技术研究，三羟异黄酮诱导人肝癌细胞SMMC-7721凋亡的分子机制研究，细菌与放线菌的16S rDNA、真菌26S rDNA D1/D2区及ITS区的分子鉴定体系，载体构建技术体系及其基因靶点的定点诱变和靶序列缺失、改造技术体系6个方面来研究细胞培养在分子生物学中的应用，以阐述细胞培养的重要性。

1.心肌细胞培养

培养心肌细胞能提供单个细胞的同源集落，在记录腔内可视并容易控制。培养方便，定量、重复性好，均一性不受神经体液因素，在分子生物学技术研究成熟心肌细胞(如Ikur分子基础的研究中应用广泛；

心肌细胞位于心肌内膜内。一般认为，正常成年心脏的心肌细胞不再分裂。因此，心肌细胞最初多采用动物或人的胚胎心脏以及刚出生动物的心脏，如乳鼠以及其他刚出生动物的心脏或动物、人的胚胎心脏，这就是ECM。但ECM与ACM相比，在功能和结构上均有差异：ECM用途存在一定的局限性，ACM更适宜做电生理和细胞膜离子通道的研究单个因素干预实验方面更具有代表性

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[1,2]

；ACM在进行。

2.植物体细胞培养再生技术体系

棉花是重要的经济作物之一，棉花生产对于我国棉农收入和国民经济的发展具有重要的意义。随着基因工程和分子生物学的发展，转基因技术正广泛地应用于现代植物育种中。然而，建立高效而稳定的植物体细胞培养再生技术体系是植物遗传转化和植物基因工程的基础。此外，棉属野生种中具有陆地棉栽培种所缺少的许多优良性状，通过棉种间的体细胞杂交技术获取种间杂种转育野生棉的优良性状是一条行之有效的技术途径，而建立一套适合这些野生棉种的体细胞胚胎发生和植株再生体系是体细胞杂交创造种间杂种的基础和先决条件。本研究在前人工作的基础上，以四倍体野生棉种毛棉(G.tomentosum Nutt& Seem)为材料，四倍体陆地棉(G.hirsutum L.)珂字棉201为对照，研究野生棉种毛棉体细胞培养过程中的影响因素，以建立适合于四倍体野生棉的体细胞培养体系。

[6]3.马立克氏病病毒分子生物学诊断技术研究

通过与SDS-蛋白酶K法、高纯度PCR模板提取试剂盒(宝灵曼公司产品)、NP-蛋白酶K法比较,研究小组建立了用TLS(三乙醇胺月桂酸硫酸盐)代替传统 的SDS-蛋白酶K提取DNA的方法,对细胞培养物、血液样品提取DNA,经琼脂糖凝胶电泳、PCR检测,结果表明,TLS法是一种快速、简便的提取高质量DNA的方法.利用地高辛标记马立克病病毒(MDV)GA株BamHI-L及其六个亚片段制备核酸探针,与MDV1型(京-

1、MD

2、MDV3的核酸无同源性,这与Ono等(1992)的报道:在非严格杂交条件下,MDV2 BamHI-F片段与MDV BamHI-L片段有同源性的结论不同.根据BamHI-L片段的核酸序列设计了针对pstI亚片段的寡核苷酸引物,建立了用0.3U Taq酶的10μl反应体系的微量PCR方法,通过对病毒感染细胞培养物DNA和京-1株接种鸡血液DNA的扩增,结果表明,该引物介导的微量PCR是MDV1特异的,MDV2(SB-1)、MDV3(Fc-126)及正常细胞DNA都没有任何扩增产物.敏感性试验表明微量PCR能从0.1pg京-1株感染细胞DNA中检测到MDV DNA,早期感染样品检测结果表明,微量PCR能从京-1株接种鸡的血液中于第5天检出MDV DNA.PCR产物的RFLP结构表明:京-1株和MD株的产物在 BgII、TaqI、xbaI酶切位点上没有变化.4.三羟异黄酮诱导人肝癌细胞SMMC-7721凋亡的分子机制研究

三羟异黄酮对肝癌的抑制作用研究,通过细胞培养发现其可诱导肝癌细胞凋亡。通过体外细胞培养和分子生物学技术,检测人肝癌细胞SMMC-7721凋亡过程中相关蛋白基因的表达,可以探讨三羟异黄酮诱导肝癌细胞凋亡的分子机制.方法:应用体外人肝癌细胞系SMMC-7721细胞培养技术,采用MTT法观察三羟异黄酮对肝癌细胞的增殖抑制作用,选择合适的实验剂量.HE染色观察凋亡细胞的形态学表现,琼脂糖凝胶电泳观察凋亡细胞的DNA Ladder.采用细胞免疫组化检测三羟异黄酮诱导人肝癌细胞凋亡过程中相关蛋白p53、Caspase-

3、Survivin的表达,采用RT-PCR法检测Caspase-

3、Survivin在基因水平的表达。

[7]5.细菌与放线菌的16S rDNA、真菌26S rDNA D1/D2区及ITS区的分子鉴定体系

细菌（包含放线菌）基因组有5S、16S和23S三种rDNA.16S rDNA大小在1500bp左右，其所代表的信息量适中，是进行分类研究的理想靶位。利用16S rDNA两端的引物PCR扩增未知菌株的16S rDNA把序列，并进行后续的DNA测序，与Genbank中已知序列进行同源性比较后判定细菌种类，可将细菌划分到属或种。真菌基因组中编码核糖体RNA的基因为26S rDNA、5S rDNA、18S rDNA和5.8S rDNA。利用rDNA的保守序列设计引物，对未知真菌的26S rDNA D1/D2区域序列或ITS区进行PCR扩增，测序后与Genbank中已知序列进行同源性比较，可将真菌划分到属或种。我公司具备完整的细菌和真菌分子鉴定成熟方案和技术操作体系，已顺利完成近万株海洋细菌与放线菌、霉菌、酵母和来源于土壤的微生物、植株体内生菌的分子鉴定工作。

6.载体构建技术体系及其基因靶点的定点诱变和靶序列缺失、改造技术体系

载体是外源基因导入宿主菌的必需媒介。依据目的基因的来源，灵活选择不同的克隆方法，包括从基因组中分离目的基因，由特定mRNA逆转录合成cDNA后再进行克隆和PCR体外扩增目的片段进行克隆等。同时，根据需要对特定的基因靶点进行定点诱变和靶序列缺失、改造。

【参考文献】

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