猪圆环病毒2型(PCV2)衣壳蛋白表达综述_猪圆环病毒2抗体种类

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PCV2是圆环病毒科(Circoviridae)圆环病毒属成员，为单股环状负链无囊膜的DNA病毒, 为已知的最小动物病毒之一，约17~ 20nm, 二十面体对称。根据病毒的抗原性和基因组成不同，可分为2种基因型或称血清型, 即PCV1型和PCV2型。PCV1无致病性。PCV2具有致病性，基因组全长1767bp或1768bp，包括11个读码框，其中ORF2编码病毒的主要结构蛋白)核衣壳蛋白(Cap)，其N端包含一个由41个氨基酸残基组成的的核定位信号(Nuclear location signal，NLS)，与PCV2在细胞核内定位有关。Mahe和Liu等分别在sf 9真核细胞及大肠杆菌中进行了PCV2Cap蛋白的表达, 但Cap蛋白的表达量较低。为了提高Cap蛋白的表达量, 本实验成功构建去除NLS的重组质粒, 并对其进行表达、纯化、鉴定。

1材料和方法

1.1pcv-581重组质粒的构建

1.1.1PCR扩增去除NLS基因的pcv-581

1.1.1.1引物的设计与合成: 根据本实验室保存毒株的测序结果, 用Oligo6.0设计删除核定位信号特异引物(由大连宝生物工程公司合成), 并引入限制性内切酶BamHI、HindIII(加下划线表示)。上游引物: ACAGGATCCATGGCATCTTCAACAC;下游引物: GAAAGCTTT TCATTAAGGGTTAAGT;产物长度581bp。

1.1.1.2PCV2核酸的提取: 取接种PCV2病毒的PK-15细胞悬液500uL, 常规方法提取, 最后加20uL灭菌去离子水溶解,-20度保存。

1.1.1.3PCR扩增: PCR的反应体系总体积25uL: 上、下游引物(10uLmol/L)各1.0uL，10×RCR Buffer2.5uL、dNTP3.0uL(2.5mM each)，提取的DNA2.0LL,Taq酶0.25LL(5U/ LL, TaKaRa), 去离

子水补到25LL。反应参数为: 95e , 5min;94e, 45

s;55.9e, 45s;72e, 45s;30个循环;72e , 7min。

取5LLPCR产物进行电泳分析(见图1)。

1.1.1.4PCR扩增产物的酶切、回收: 醇沉淀PCR

扩增产物、酶切、回收。具体操作方法如下: PCR

产物补到100LL, 加入等体积异丙醇, 置-20e 静

止过夜, 13 000r/ min离心15min弃上清, 加入

600LL75%乙醇, 7000r/min离心5min, 倒掉上清,晾干, 加入10LL灭菌去离子水溶解。将醇沉产物

进行BamHI酶切, 体系为20LL: 10@buffer K2LL,BamHI 1LL(15U/ LL , TaKaRa), 醇沉产物10LL,H2O7LL, 37e 酶切1h。将酶切产物继续醇沉淀

(方法步骤同上)后进行HindIII(15U/ LL, TaKaRa)

单酶切, 酶切体系同上, 回收目的片段。

1.2pQE-pcv581重组质粒的构建和鉴定: 将载

体pQE-32(QIAGEN)质粒用BamHI 和HindIII双

酶切, 做100LL 酶切体系: 10@ buffer K10LL,BamHI2LL, HindIII 2LL, pQE-32质粒70LL, H2O

16LL。37e 酶切2h15min, 用胶回收试剂盒回收

(TIANGEN, 操作按照说明书进行), 目的片段和载

体常规方法连接、转化M15、筛选阳性重组质粒

pQE-pcv581。酶切鉴定(见图2)。

1.3重组蛋白的诱导表达及纯化

从含有氨苄抗性的琼脂平板上挑取单个阳性

菌落接种到5mL氨苄抗性(100Lg/ mL)的LB液体 培养基中, 37e 过夜振荡培养、活化, 取过夜活化 的培养物按照的比例接种到5mL含氨苄抗性的液 体LB培养基, 37e 振荡培养, 培养至OD600nm达 0.4-0.6, 然后加入IPTG(TaKaRa)至终浓度为0.2mmol/ L、0.4mmol/ L、0.6mmol/ L、0.8mmol/ L、1.0mmol/L、1.2mmol/L继续培养, 分别在诱导前、诱 导1h、2h、3h、4h、5h、6h、7h取样, 取1mL菌液离心