河豚鱼毒素_河豚鱼毒素化学名称
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海 南 大 学
食品学院食品质量与安全系
课 程 考 核 论 文
分数：
课程名称：学科前沿
论文名称：河豚鱼毒素（TTX）的相关研究和进展
姓 名： 陈 保 学 号： 20090802310001 年 级： 09级 完成日期：2011 年 12 月 3 日
河豚鱼毒素（TTX）的相关研究和进展
陈保
20090802310001
(海南大学食品学院 09级食品质量与安全一班)摘要：河豚毒素(Tetrodotoxin，TTX)是一种毒性很强的海洋神经毒素，在自然界中分布广泛，不仅存在于河豚属的鱼类．还存在于卷贝、虾虎鱼、蓝斑章鱼以及海星等众多的海洋生物中，一些海洋细菌也能产生TTX，因其具有镇痛、降压、抗心律失常、局麻、戒毒及抑瘤的功效，而且能特异性阻滞钠离子通道，在生理学研究中，已成为机制研究的工具药，因此具有极高的经济价值和医疗价值。目前，国内、外对TTX已有大量的研究报道，本文就TTX的相关研究的进展作一粗略的回顾与跟进。
关键词：河豚鱼毒素;TTX Abstract TTX is an extremely potent toxins which is isolated from puffer fish at first and is widely distribution in nature not only in the species of puffer fish but also in many kinds of animals in ocean like Roll Shell , Goby , Blue spotted Octopus and Starfish.Some of them can produce TTX.TTX has highly commercial and medical value due to The study in physiology shows that TTX have medical function like analgesia, to bring high blood preure down, anti-arrhythmia, partly anesthesia, Drug detoxification and anti-tumor, especially it could be the Blocking agent of Na.So far, there are many study reports of TTX all over the world and this paper will do some rough reviews and follow-up.Key words: Tetrodotoxin TTX +1 起源
1909年，日本学者田原良纯从豚属鱼卵内提取到一种粗品毒素，命名为河豚毒素(tetrodotoxin , TTX)。1950年，横尾晃获得了TTX结晶状物质。TTX是一种毒性极高、相对分子质量小的非蛋白毒素，其结构为一种笼形原酸酯类。TTX的相对分子质量为319.3它具有一种很独特的分子结构，通常以两性离子的形式存在，既可以带阳离子也可以带阴离子。从78 世纪C8 年代起，国内外学者对TTX 的来源进行了一系列的研究，发现TTX 不仅存在于河豚鱼中，而且广泛分布在其他动物体内，同时发现多种细菌可产生TTX，但其中既有外源性学说又有内源性学说，至今仍无法下定论。几十年来，对TTX 的化学特性、药理毒理作用等方面的研究收获很多，大多数学者认为，TTX 的主要药理作用是通过抑制神经细胞的Na+内流，阻断神经兴奋的传导。此后，大多数研究工作都围绕此展开。
1.1 TTX的外源性起源学说
在TTX 起源学说上研究最多的就是东方豚，一般认为降海洄游的河豚产生TTX 的可能性有：①东方豚下海后在海水环境中自身产生TTX；②海水中某些生物含有TTX，被河豚吞食后吸收并储藏浓集于体内；③海洋中许多生物的代谢产物中含TTX 从目前的研究来看，河豚自身产生TTX 的可能性不大，因为除河豚外，海洋中还有许多河豚喜食的生物体内都含有TTX。再者，生存于淡水中未经降海洄游的河豚体内检不出TTX，也说明河豚自身不产毒，但在投喂含TTX 的饲料一段时间后，在其体内又能检出TTX。因此很有可能是通过食物链在河豚体内聚集TTX，而且海洋中许多含毒细菌黏附河豚喜食的生物，进入河豚体内后就与其构成互利共生的关系，河豚就可通过皮肤腺的暴露来释放TTX，从而起到抵御天敌的作用。
Matsui等于1985年通过人工培育河豚的幼苗试验，提出了河豚鱼TTX 的体外起源因素，这种假定也认为所有能产生TTX的生物都与其体内能分泌TTX 的微生物有着密切联系，并
且已被随后从各种携带TTX的生物体内提取出来的能产生TTX的细菌所证实，另外TTX的累积机制不仅可通过食物链获得，其自身肠道内细菌也能产生TTX。因为海洋中有些生物也吃与河豚同样的食物，但它们体内并不含有TTX，估计河豚体内有一种能够储藏TTX的机制。目前大多数研究者都认为，河豚体内的TTX是受食物链和微生物双重影响的结果
河豚不仅存在个体差异，并且其体内各组织中含TTX的量的差异也很明显，一般卵巢和肝脏中的TTX最多，肠道次之，皮肤和肌肉中则微量或没有。Yuji将河豚的肝脏组织培养在含TTX的培养液中，发现它能吸收TTX，证明河豚肝脏并不能分泌TTX，而是吸收体外的TTX。这也进一步证明了河豚体内的TTX是外源性的TTX不仅存在于河豚体内，在其他多种生物，包括毛颚类、腹足类、软体动物、棘皮类、两栖类、纽虫、海藻等体内也发现了TTX或TTX类似物。这些含有TTX的生物有一个共同点，即其体内含有多种能分泌TTX及其类似物的细菌，近年来，已发现了多种能产生TTX的细菌，主要包括放线菌、弧菌、假单胞菌、发光菌、气单胞菌、芽孢杆菌等，Wu Zhenlong等通过分离和筛选河豚各个器官内的细菌，从36种细菌中挑选出了20种能分泌TTX的细菌，并发现卵巢和肝脏中的TTX含量高，其内部所含的菌株数量和毒性也都比其他组织高，从而说明河豚所含的TTX与其共生细菌密切相关。
1.2 TTX的内源性起源学说
许多研究者的研究结果都证实了TTX的食物链起源，他们认为许多海洋细菌能产生TTX，作为河豚食物的一些动物如海星等也含有TTX而培育的河豚无TTX表明河豚没有产生TTX的能力，但后来由细菌产生TTX的观点遭到了反驳，Matsumura在1995年就发现从解藻朊酸弧菌(Vibrio alginolyticus)中提取出来的TTX并没有与TTX的单克隆抗体发生反应，认为生物鉴定法存在弊端，因此有必要重新认识TTX是由细菌产生的这一观点。
Kendo在1998年，为了证实河豚TTX的产生是其内源性的原因，提取了星点东方鲀成熟的卵细胞进行人工受精及培育，发现胚胎在孵化过程中其体内的TTX含量一直在增加，这表明增加的毒素是胚胎的产物。
由此可知河豚体内的TTX可能并非直接来源于细菌，而是河豚本身与其体内共生细菌共同的产物，河豚等动物自身是否具有分泌毒素的功能，以及TTX如何在其机体各器官内发生转移等，还有待进一步的研究。TTX的毒理机制及其控制
2.1 TTX的化学特性与毒性
TTX的相对分子质量为319.3，通常以两性离子的形式存在，既可以带阳离子也可以带阴离子。药理实验表明，TTX 分子的阳离子形式比两性离子形式的作用更强。河豚毒素溶于水但不溶于无水乙醇和普通有机溶剂。纯的TTX 在环境温度下是稳定的，如遇强酸和强碱时易脱水，分解成无毒的产物。0.05g河豚毒或0.01g河豚酸能致体重10kg的狗中毒死亡。
2.2 TTX 的毒理机制
河豚毒素的毒理作用主要表征是阻遏神经和肌肉的传导。河豚毒素除直接作用于胃肠道引起局部刺激症状外，被机体吸收进入血液后，能迅速使神经末梢和神经中枢发生麻痹，继而各随意肌的运动神经麻痹；毒量增大时毒及迷走神经，影响呼吸，脉搏迟缓；严重时体温和血压下降，最后导致血管运动神经和呼吸神经中枢麻痹而引起迅速死亡。对TTX的作用机制已
+研究得十分清楚，TTX选择性地抑制可兴奋膜的电压依赖性Na通道的开放，从而阻止神经冲动的发生和传导，使神经肌肉丧失兴奋性。此后，大多数研究工作都是围绕着TTX阻断可+兴奋组织的Na通道而展开的。
2.3 TTX的控毒研究 迄今，河豚中毒是鱼类中毒中最为严重的一类，因食河豚中毒的患者病死率高达60%。TTX 大
量存在于河豚中，如果不慎食入了未经妥善处理的河豚，大约在20 min 内就会出现初级的神经系统症状麻痹症，呼吸系统衰竭、痉挛、心脏跳动不规律，而且经常引致死亡。因此，对TTX 控毒的研究非常必要。李勤等1998年就对暗纹东方鲀肝脏热去毒的效果进行了研究，结果表明，TTX 在高于120℃的温度下不稳定，温度越高，稳定性越差；野生暗纹东方鲀肝脏中的毒量很大，但在150℃加热4 min 即可将毒素去除干净。东方鲀体内的TTX 与其摄食有关，很多研究者发现从食物链上来控制东方鲀的毒性效果明显。华元渝等在1994~2001年进行了暗纹东方鲀全人工繁殖、苗种培育、商品鱼养殖全过程的控毒技术研究。在养殖全过程中，通过运行生态型再生式水循环养鱼系统来改善水体生态环境，通过投喂自繁淡水轮虫和自制无毒配合饲料等措施，从食物链环节控制河豚毒素TTX 的来源，可达到控毒的目的。对经控毒的家化暗纹东方鲀亲本，采用高效液相色谱仪和荧光分光光度计联合法随机抽样检验，结果表明，其体内4种组织器官中的TTX 平均含量低于2μg/g，属基本无毒。
河豚毒素是一种非蛋白型剧毒性海洋生物毒素。目前已有生物检测法、化学检测法、免疫测定法和组织培养法等应用于河豚毒素的研究中，为寻求TTX 的解毒剂，国内外已相继制备出了多种TTX 的单克隆抗体，在探求TTX 解毒上又前进了一大步。提取和检测
3.1 材料和方法 TTX的提取
取河豚鱼的内脏捣碎后，分为四份，分别加人5倍量的甲醇、乙醇、乙酸、水，然后将装有四种不同溶剂的提取瓶置于60℃恒温水浴锅中8 h，使rn(充分溶解于溶剂中。取出三角瓶，3500 rpm离心10min，分别收集上清液和固体物，将固体物再重复以上步骤2次，合并上清液。若脂肪过多可用乙醚进行脱脂处理。将上述粗提液减压蒸馏。得到的少量液体按照溶剂的不同编号为1号(乙酸提取)、2号(甲醇提取)、3号(乙醇提取)、4号(水提取)处于冰箱中备用。
TTX的鉴定与检测
选择体重为25±2 g左右的小白鼠，随机分为两组，分别腹腔注射O．8 ml、1．0 ml上述提取液，观察小鼠症状。
薄层层析法
硅胶板的制作：称取硅胶H 50 g于研钵中，加人25 ml 0．5％的CMC，在研钵中研磨混匀至糊状无颗粒将其倒在层析板上，平铺均匀，(这样可铺三块长17 cm、宽12 cm的层析板)于110℃活化半小时后取出备用。
点样：20，1样品液点于活化好的硅胶板上，点样点距离板底1．5 Cm，点样斑点直径控制在2 mm左右，样品间距约1．5 cm。
展层：首先将展开剂置于层析缸中5 min预平衡，再将点好样的层析板放人层析缸巾室温展开(展开剂为正丁醇：醋酸：水=2：l：1)，待展开剂前沿走至距板顶1．O cm时取出，自然晾干。
显色：用喉头喷雾器将3 mol/l KOH溶液均匀喷至层析板上，吹风机吹干，于160℃下烘15～20min，取出10 min后立即扫描。
3.2 结果
小白鼠经腹腔注射四种溶剂提取的河豚内脏提取液后，均呈现中毒症状，观察症状如下：注射O．8 ml样品液的小鼠最初表现平静，过30 min左右开始浑身打颤，最后身体上的毛都湿了。但经过5--6 h后，又恢复平静。随着时间的延长，小鼠也恢复正常，大约一天的时间，小鼠完全恢复正常。而注射1 ml样品液的小鼠最初也是表现为平静，继而出现不安，突然旋转，大呼吸，最后突然跳起，翻身，四肢痉挛。腹部朝上死亡。该死亡症状与文献报道的河
豚毒素中毒死亡症状一致。小白鼠的死亡时间却不一致，2、3、4号提取液致死时间几乎相同，且时间较长为6--8 h，而1号提取液对小白鼠的致死时间相对较短为4--5 h。
薄层层析结果如下图所示：肉眼观察1、2、3、4号提取液经薄层层析后在层析板上分别呈现四个黄褐色斑点，这些斑点直径不等，但展距(Rf值)相近，差别可能是溶剂的极性不同引起的。经复日成像系统扫描后这四个斑点清晰可见：1号所得的主斑点的直径相对较大。
3.3 讨论
物实验是检验药物的药理活性的简洁、快速、直观的一种方法。长期以来，动物药理实验一直是药物学者开发和研制新型药物的有利武器。本实验中采用的两组小鼠实验因为注射的样品量不同，直接导致了小鼠的不同行为症状，注射0．8 ml样品液的小鼠大量出汗、打颤、但没有死亡，2天后恢复正常。通过对注射lml样品液的小白鼠中毒实验死亡症状的观察，验证了甲醇、乙醇、乙酸、水这四种溶剂均能提取出河豚毒素，但死亡时间不一致可证明其提取的毒量的差异，因均取材于同一河豚鱼故可抵消毒素的不同和毒力强弱这些因素带来的影响，所以小白鼠从注射到死亡的时间越长，说明其含毒量越低。即2、3、4号的含毒量较l号乙酸提取的河豚毒素含量低。从此实验可初步得出河豚毒素经乙酸提取的效果要好于甲醇、乙醇、水三种溶剂。
3．2薄层层析作为一种传统的分离和鉴定方法，具有方法简单易行、方便灵活、灵敏度高、重复可靠、易操作、分离效果好、快速、用样量少等优点，在许多领域都得到广泛应用，尤其适合于微量TTX的定性和定量分析。上述提取的1 2 3 4号提取液经薄层层析后在层析板上均可见四个黄褐色斑点，这与文献报道的河豚鱼体内含有河豚毒素、河豚酸、卵巢毒素和肝脏毒素相吻台，且各自的Rf值相近，其中一个斑点特别明显，推测可能为河豚毒素。从扫描结果分析对比平行斑点的寅径之间存在显著差异：1号提取展开的四个斑点直径均比2、3、4号的斑点直径大，尤其是河豚毒素的斑点直径更为明显。也就是说，1号乙酸提取的河豚毒素含量高于其他三种，这与小白鼠中毒实验得出的结论一致。
3．3河豚毒素毒性强度因不同种类和不同季节而有差异，一般在春、夏季及卵巢孕育阶段毒性最强。以卵巢、睾丸和肝脏为主要有毒部位，其次为肠道、血液、鳃、肾及皮肤等。河豚毒素对中枢神经和神经末稍有麻痹作用，其毒性较氰化钠大1250倍，0．5mg即可致人中
毒死亡。
此外，还有，高效毛细管区带电泳检测河豚鱼中河豚鱼毒素，ESI/MS/MS法。在这就不赘述了。应用
TTX的麻醉作用比常用麻醉药可卡因强16万倍，毒性比氰化钠强1250倍；而且河豚毒素还具有对神经的选择性作用。因此，河豚毒素至今仍作为工具药广泛地用于生理学和药理学研究中，其潜在的临床应用价值也一直受到人们的关注。经过提纯的TTX 具有多种药用价值。河豚毒素针剂可作为镇痛剂、镇静剂及镇痉剂等用于神经性病患的治疗； 河豚毒素可作为广谱抗生素的替代药物，既可抑制革兰阴性的霍乱弧菌、痢疾杆菌、伤寒杆菌，又可抑制革兰阳性的葡萄球菌、链球菌；有国内学者报道已发现TTX 具有抗肿瘤作用，并发现其抗肿瘤活性显著高于珍珠贝黏多糖。TTX 在药理学上的作用也越来越大。TTX 对Na+通道的选择性极高，能阻止Na+进入细胞，因而可阻止神经和肌肉产生兴奋活动。临床常用
+的抗心律失常药如奎尼丁、利多卡因等，不仅阻断心肌Na+通道，也同时影响Ca+或K通道；
+而TTX 选择性阻断Na+通道，不影响Ca+、K通道。TTX 对大鼠心肌缺血早期心律失常也有对抗作用，微量的TTX(2μg/g)可显著增强心得安、利多卡因或戊脉安的抗心律失常作用。TTX 的显著作用之一是使血管逐渐麻痹，外周血管阻力减小，造成血压下降，产生严重的低血压，5×10-4就可引发降压。给家兔和大鼠静脉注射国产河豚毒素，均能产生降压作用。应用化学刺激和热刺激法研究证实TTX 还有明显的镇痛作用，并有量-效关系。徐英等采用福尔马林致痛实验，分别单独肌注TTX 及将TTX 与吗啡联合给药，发现TTX 对福尔马林所致疼痛有镇痛作用，与吗啡联合应用具有协同镇痛效应。基于河豚毒素广阔的医药用途，有必要大力开展河豚毒素的提取研究和应用。但由于河豚毒素含量低，提取所得含量更低，加上目前河豚资源已经利用过度，制约着药源供应，以致河豚毒素制品价格昂贵。为此，有些学者建议在进一步开展河豚毒素的基础研究和完善提取工艺的同时，还应探索人工合成河豚毒素的生物技术，为河豚毒素制药产业提供价廉质优的药源，也为TTX 的广泛应用奠定基础。延伸
5.1非河豚鱼源中河豚毒素提取的研究进展 5.1.1 TTX的获取来源
自从1909年田原良纯从河豚卵巢中提取出河豚毒素粗品后，现在还发现多种海洋生物中含有河豚毒素，如1964年美国Mosher等从加州蝾螈（Taricha torosa）中分离得到河豚毒素；1975年，Kim等从哥斯达黎加的斑足蟾属的（Atelopus varius , A.ambulalorius , A.Chiriquiensis）等种的箭毒蛙的皮肤中测到河豚毒素，以及虾虎鱼（Gobiucriniger）、兰斑章鱼（Octopus maculosus）、娑罗法螺（Charonia sauliae）等软体动物、花纹爱洁蟹（Atergatis floridus）、Astropecten属海星类、扇蟹科蟹类、扁形动物扁虫类、纽形动物纽虫类、环形动物多毛类、毛颚动物、箭虫类织纹螺、法螺等履足动物中均出现了河豚毒素。研究发现，一些微生物中也含有河豚毒素，如假单胞菌属（Pseudomonas）、弧菌属（Vibrio）、发光杆菌属（Photobacterium）、气单胞菌属（Aeromonas）、邻单胞菌属（Plesiomonas）、别单 胞菌属（Alteromonas）、不动杆菌属（Acinetobacter）、芽孢杆菌属（Bacillus）等，放线菌主要是链霉菌属（Streptomyces）等。
5.1.2 微生物中河豚毒素的提取 现已证实，微生物中河豚毒素的产量很低。武振龙等培养芽孢杆菌RG-3B6、RG-33B，通过活性炭吸附、Bio-Gel P2聚丙烯酰胺分子筛层析、大孔树脂吸附层析，D152阳离子交换
树脂层析、真空冷冻干燥等手段从菌丝体中分离出河豚毒素，但产量很低。为此，可以尝试以下两种方法：一是通过诱变育种，筛选高产菌株；二是通过研究微生物产生代谢物河豚毒素的机制，找到相关酶蛋白与调节因子，对微生物产河豚毒素进行人为干预，或克隆与产河豚毒素相关的酶蛋白的DNA，转化后发酵生产河豚毒素。
5.1.3 海螺、海藻中河豚毒素的提取
在产河豚毒素的海洋生物中，除微生物外，还发现一些海螺、海藻等多种生物含有河豚毒素，且部分生物中的河豚毒素含量很高，如光织纹螺、节织纹螺的河豚毒素含量有时可以达到每克软组织几百个鼠单位以上。这些生物中形成河豚毒素的机制现在还没有完全清楚，一种看法是由于摄入含有河豚毒素的饵料后，滤过性积累产生的，像法螺等大型的肉食性卷贝中的河豚毒素至少有部分原因是由于这种途径造成，另外一种说法是由这些生物上寄生或共生微生物产生的。我国东部沿海地区盛产各种织纹螺，年产量估计在万吨以上，其中已经发现多种产河豚毒素的织纹螺。由于以前每年都有发生织纹螺中毒事件，现在我国采用法律手段禁止织纹螺开采和买卖。如能从织纹螺、海藻等海产品中提取河豚毒素，将为河豚毒素的提取提供新的原料来源。目前国内外尚未有在织纹螺中提取河豚毒素的报导，织纹螺中的毒素成份复杂，并且大部分织纹螺中河豚毒素的含量较低，这使得从织纹螺中分离河豚毒素比单纯在河豚鱼中分离河豚毒素要更加困难。
参考文献
苏捷，张农，姜琳琳 非河豚鱼源中河豚毒素提取的研究进展[J].渔业现代化，2007,34(3)黄军，严美姣，陈国宏 河豚毒素的起源及其研究进展.生物技术通讯，2006,17(6)杨春，苏秀榕，李太武，蒋双 低毒河豚鱼毒素的提取和检测.天然产物研究与开发，2003,15(5)
