分子克隆3—蛋白质相互作用研究技术_蛋白质相互作用的研究

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蛋白质相互作用研究技术

一、双杂交和其他双成分系统

二、用GST融合蛋白进行Far Western 印记来检测蛋白质-蛋白质相互作用

三、用GST融合蛋白沉降技术检测蛋白质-蛋白质相互作用

四、通过免疫共沉淀确定结合蛋白

五、采用GFP和荧光共振能量转移技术测定蛋白质相互作用

六、利用BIAcore通过表面胞质基因共振光谱学分析相互作用的蛋白质

七、。。

导言

一、多数蛋白质研究工作可分为四个类别：

1.二、蛋白质-蛋白质相互作用研究的3个层次

1.研究的目的是确定各种可能与目标蛋白相互作用的蛋白质，此时要撒大网，因此生理意义暂时不被看重；

2.感兴趣的相互作用蛋白质已被确定，研究的目的是通过详细分析生物学功能，来确定相互作用的生理学意义和影响。

3.某中相互作用已被发现，并且被证实是生理性的，此时研究的目的是提供一种高通量的方法，以发现能够按所需的方式调节这种相互作用的试剂。

三、与蛋白质相互作用直接相关的另一领域是分子模建：

四、各种技术应用分析：

1.所列方案（1~6），不能证明观察到的相互作用是直接或间接的，如果研究目的是确定直接相互作用，最终使用的方法中必须采用纯化的蛋白质。

2.特定蛋白质的内在性质在某种程度上决定了哪种技术能有效的用于分析蛋白质相互作用；`` 3.双杂交和基于GST-融合的筛选方法（方案1，2，3）适用于撒大网式的应用研究。方案2，3只是用来确定体外的相互作用,这种体外的相互作用应当进一步在体内通过单独的方法来证实。

4.对于相互作用在生理上的证实和探索，采用内源蛋白质的免疫共沉淀（方案4）和FRET（方案5）的方法更可取；

5.为快速分析过去已确定的相互作用，双杂交和GST沉降分析具有一些明显的优势；

一、双杂交和其他双成分系统

二、用GST融合蛋白进行Far Western 印记来检测蛋白质-蛋白质相互作用(一)`引言

1.细菌表达的谷胱甘肽S-转移酶(GST)融合蛋白被用于直接测定蛋白质-蛋白质相互作用，以及亲和纯化。

2.融合蛋白的设计依赖于所选择的检测方法和计划采用的筛选方式。

[1].对于文库筛选，将尽可能大的探针蛋白包括进去可以增加检测到的相互作用的数目。

[2].如果探针蛋白含有已知的相互作用区，并且他们用于证实预期的相互作用，那么仅含有这些结构区域的融合蛋白可能更好。3.GST成分可以二聚化并能产生背景。

4.筹划Far Western 印记实验需要考虑的因素：

[1].最重要的因素是：在没有过多降解和不溶解蛋白质的条件下合成融合蛋白的能力。

[2].从不同融合蛋白制备物得到的结果可能有所不同，所以监控融合蛋白的状态是非常重要的，这包括纯化期间和纯化后，如果蛋白质被存放，还包括使用前后。[3].有助于确认蛋白质-蛋白质相互作用特异性的两个对照是 a)用融合蛋白突变体探测，这种突变体可以破坏相互作用； b)用标记GST来探测膜。？

[4].最终，还要确定是否用变性/复性循环来探测膜，这样设计是为了使错误折叠的蛋白质重新折叠成天然构像。

a)从SDS-PAGE转移到膜的蛋白质通常不需要变性和复性，如果在检测SDS-PAGE时没有产生蛋白质-蛋白质相互作用，那么引入变性/复性过程可能产生阳性结果； b)在探测表达文库覆盖印记的滤膜时，许多研究人员发现变性/复性是必需的步骤。[5].5 5.5(二)实验方案

1.Materials [1].缓冲液和溶液 [2].2.Methods: [1].放射标记蛋白探针的制备 [2].探测膜

3.3(三)注意事项

三、用GST融合蛋白沉降技术检测蛋白质-蛋白质相互作用

(一)`引言

1.GST-pull down 利用了GST对谷胱甘肽偶联球珠的亲和性，从非相互作用蛋白的溶液中纯化相互作用蛋白。该技术对探测蛋白质在溶液中的相互作用特别有用，而这种相互作用在膜的分析中可能是检测不到的。2.GST-pull down通常有两种应用：

1)确定融合（或探针）蛋白与未知（或靶）蛋白间新的相互作用；

a)未知蛋白可能受浓度的限制，为确定新的相互作用，未知蛋白质必须以足够的量存在，以使这种相互作用能用所选择的检测方法观察到。b)放射标记的细胞裂解液时最常用的蛋白质来源

c)在实验前要考虑：实验目的，探针蛋白的表达等。2)证实探针蛋白与已知蛋白间可疑的相互作用；

a)各种蛋白质来源可用于确定和探询这种相互作用。

b)用于检测相互作用的方法是由能否获得对靶蛋白的抗体来决定的；如果抗体得不到，那么就可利用S标记的体外翻译蛋白或靶蛋白用表位做标签。必要时，可用编码蛋白的质粒转然培养细胞，以增加分析蛋白质的丰度。c)控制质量作用（如非特异性聚集）的影响，并确认探针蛋白同靶蛋白分子间结合的特异性是非常重要的。

d)结合特异性的最好控制是包括一种带有突变相互作用域的GST融合蛋白，丧

35失与这种突变探针蛋白的结合就表明靶和探针间的正常结合是特异性的。e)测试假定靶蛋白与GST间的结合也很重要。

3)3

这两种实验的设计和实施都有所不同。

3.GST-pull down必须对每个蛋白质复合物的分析进行优化：

1)发生相互作用的缓冲液；

2)与融合（探针）蛋白混合的把蛋白的量；所需材料的量主要由把蛋白的丰度和相互作用的亲和力决定（实验开始时两个参数通常是未知的。）3)清洗球珠的条件； 4.4(二)实验方案 A.材料

1.缓冲液和溶液

1）裂解缓冲液：? 2）50%谷胱甘肽琼脂糖球珠悬液：在裂解缓冲液中配。（Beads are often supplied by commercial vendors in solutions containing alcohols.It is important to wash the beads thoroughly in GST pull-down lysis buffer and to generate a 50/50 slurry of beads in GST pull-down lysis buffer prior to use.）

3）溶于50mmol/L Tris-Cl(pH 8.0)中的还原型谷胱甘肽（20mmol/L）

（glutathione;γ-L-glutamyl-L-cysteinylglycine, GSH）

4）

2.专用设备

1)沸水浴

2)翻转样品旋转仪（有，无？）3)谷胱甘肽琼脂糖球珠 3.细胞和组织 4.附加试剂 B.方法

预清除细胞裂解液

1.将细胞裂解液与50l的50%谷胱甘肽琼脂糖球珠悬液和25g GST在4℃翻转混合孵育2h（实验室内如何实现？）。需要检测相互作用的裂解液的量是高度可变的。开始用1×106~1×107个细胞的裂解液。（细胞裂解液提前制备好是否可以？若提前制备好，放于4℃还是-20℃）

a)预清除步骤主要是从裂解液中除去与GST成分或球珠有非特异性相互作用的蛋白质。b)如果相互作用的检测主要是用针对候选相互作用蛋白质的抗体，那么做预清除并不总是必须的。包含两种对照很重要：GST加球珠和仅有球珠。

c)在用35S标记的细胞裂解液用于确定新的蛋白质-蛋白质相互作用时，预清除步骤有助于降低本底。

d)实验的目的是比较GST与GST融合蛋白，有必要对每个反应制备足够量的预清除细胞裂解液。（多少算足够？以蛋白质的浓度定？还是靶蛋白的表达量来定？）

e)试剂有效的混合是成功的关键，为达到此目的，反应应在一个合理的体积中进行：一个好的起始值是500~1000l。2.在微量离心机上以最大速度在4℃离心混合物2min。（13,000 rpm）3.将上清（就是预清除的细胞裂解液）转移到新的离心管中。

探测细胞裂解液

4.设定两个含等量预清除细胞裂解液及50l的50%谷胱甘肽琼脂糖球珠悬液的微量离心管。在一个管中加约（~5-10 µg）的GST蛋白，另一管中加约（~5-10 µg）的GST融合探针蛋白。将离心管在4℃翻转混合孵育2h。两个反应中加入的探针和对照蛋白终浓度应该是相同的。（终浓度相同的意义是什么？如果融合蛋白不纯化，如何确保其浓度相同？）

5.在微量离心机上以最大速度离心样品2min。（13,000 rpm）（谷胱甘肽琼脂糖球珠的分子量，其连上蛋白后是否可以沉淀下来？）

6.在新的离心管中收集上清。这些样品可通过步骤10中的SDS-PAGE进行分析。（进行分析的目的：How much of the interacting protein was depleted from the total cell lysate.以优化实验条件）

7.用1ml冰冷的裂解液洗球珠。在微量离心机上以最大速度离心混合物1min。弃去上清。重复洗三次。（4次---cold spring harbor protocol）8.（可选）加入50l 20mmol/L的还原型谷胱甘肽到球珠中，洗脱GST融合蛋白及任何与其结合的蛋白质。在微量离心机上以最大速度离心2min。（洗脱方法的缺点：若多次洗脱，最后终体积较大，后续上样较麻烦。所以多数研究者选择将球珠煮沸以使目的蛋白与GST融合蛋白分离。）

9.将球珠（来自步骤7）或洗脱蛋白质（来自步骤8）与等体积的2×SDS-PAGE上样缓冲液混合。

检测相互作用蛋白质

10.将样品煮沸4min并作SDS-PAGE分析。

11.检测与GST融合蛋白结合的蛋白质的方法取决于细胞裂解液是否被的目的。

5S标记以及实验a)如果目的是检测与融合蛋白结合的所有的35S标记的蛋白，就在干胶仪上将胶抽干，并用X线胶片曝光进行放射自显影。

b)如果目的是检测特异性结合的蛋白质，就将蛋白质从SDS-PAGE转移到膜上，进行免疫印迹分析。

c)如果目的是确定与融合蛋白结合的蛋白质的大小和丰度，而这些蛋白质是来自非放射性的裂解液，就用考马斯亮蓝或硝酸银将胶染色。

(三)注意事项

四、通过免疫共沉淀确定结合蛋白

(一)`引言(二)实验方案

A.材料 1.缓冲液和溶液 2.专用设备 3.细胞和组织4.附加试剂

B.方法

(三)注意事项

五、采用GFP和荧光共振能量转移技术测定蛋白质相互作用

(一)`引言(二)实验方案

A.材料 5.缓冲液和溶液

6.专用设备 7.细胞和组织 8.附加试剂

B.方法

(三)注意事项

六、利用BIAcore通过表面胞质基因共振光谱学分析相互作用的蛋白质

(一)`引言(二)实验方案(三)注意事项