‘黄花梨’2个?CYP707A?基因的克隆和序列分析_克隆和序列分析

‘黄花梨’2个?CYP707A?基因的克隆和序列分析由刀豆文库小编整理，希望给你工作、学习、生活带来方便，猜你可能喜欢“克隆和序列分析”。

龙源期刊网 http://www.daodoc.com：8004/）获得同源序列；将同源序列返回到NCBI网站在线blast验证；而后以梨基因组CDS数据库得到的2条序列为参照，设计引物。PCR反应体系25 μl（模板1 μl，10 μmol/μl上游引物1 μl，10 μmol/μl下游引物1 μl，10 mmol/L dNTP mixture 1 μl，10×ExTaq Buffer 2.5 μl，5 U/μl EXTaq 0.15 μl，ddH2O 1835 μl），目的基因扩增引物见表1。以„黄花梨‟花芽总RNA逆转录成的cDNA为模板进行PCR扩增。反应程序：94 ℃预热5 min；94 ℃变性45 s，48～55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1.5 min；共35个循环，最后72 ℃延伸10 min；4 ℃保存。凝胶电泳检测PCR扩增产物（图1），并切下1 400 bp左右的目的条带，经胶回收（EasyPure Quick Gel Extraction Kit，北京全式金有限公司，中国北京）纯化，连接到PMD18T（Takara，中国大连）上，后转化到DH5α大肠杆菌感受态细胞中，在AMP培养基培养大肠杆菌，将菌液PCR鉴定的阳性克隆送至英潍捷基贸易有限公司（中国上海）测序。2 结果与分析

2.1 „黄花梨‟CYP707A基因的克隆从„黄花梨‟花芽上克隆得到2个CYP707A基因序列，通过DNAMAN比对，发现两者之间的相似性高达94.27%（图2），氨基酸相似性94.96%。为此，从梨基因组数据库找到2个基因的内含子和外显子基因组序列进行比对，结果显示其相似性为69.95%，说明这2个CYP707A基因为相似性较高的不同基因。将克隆到的„黄花梨‟CYP707A 基因分别定名为PpCYP707A4（Genbank登录号：KP279630）、PpCYP707A5（Genbank登录号：KP279631）。

PpCYP707A4的CDS序列全长为1 431 bp，编码476个氨基酸；其氨基酸序列与苹果（Malus domestica XP_008346457.1）相似性97%，与碧桃（Prunus persica XP_007210577.1）

龙源期刊网 http://www.daodoc.com 相似性90%，与梅（Prunus mume XP_008245093.1）相似性87%，与草莓（Fragaria vesca subsp.Vesca XP_004300683.1）相似性83%，与甜橙（Citrus sinensis NP_001275876.1）相似性84%。

安徽农业科学2015年PpCYP707A5的CDS序列全长为1 425 bp，编码474个氨基酸；其氨基酸序列与苹果（Malus domestica XP_008382035.1）相似性 97%，与碧桃（Prunus persica XP_007210577.1）相似性89%，与梅（Prunus mume XP_008245093.1）相似性86%，与草莓（Fragaria vesca subsp.Vesca XP_004300683.1）相似性84%，与甜橙（Citrus sinensis NP_001275876.1）相似性85%。

在线blastp分析，2个PpCYP707As基因均具有1个保守结构域，为PLN02196（图3），属于P450超基因家族。以PpCYP707A4和PpCYP707A5的氨基酸序列作为参考，从NCBI数据库上blast其他物种的CYP707A氨基酸序列，构建系统发育树。仅苹果blast到2个基因（XP_008346457.1、XP_008382035.1），其他物种均只blast到1个基因。系统发育树分析显示（图4），蔷薇科植物的CYP707A基因聚为一大支，PpCYP707A4与苹果XP_008346457.1基因，PpCYP707A5与苹果XP_008382035.1基因单独聚类。

注：a.„黄花梨‟总RNA； b.PpCYP707A4 PCR扩增； c.PpCYP707A5 PCR扩增。

图1电泳图谱图22个PpCYP707As的核苷酸序列比对注：a.PpCYP707A4蛋白的保守结构域； PpCYP707A5蛋白的保守结构域。

图3蛋白保守结构域图42个PpCY707As系统进化树2.2蛋白性质预测采用ExPASy ProtParam、TMpred、SignalP 4.1预测蛋白性质和Prot预测亚细胞定位，结果显示，PpCYP707A4蛋白的理论分子质量为54.4 kDa，理论等电点为9.01，不稳定系数为48.48，属于不稳定蛋白，分子式可写为C2493H3901N645O679S20，原子数7 338，带负电荷（Asp + Glu）氨基酸50，带正电荷（Arg + Lys）氨基酸59，脂溶系数为9239，GRAVY为-0.100，是亲水性蛋白；在6～23位点含有一个由内向外的跨膜螺旋结构，8～26位点有一个由外向内的跨膜螺旋结构；不含信号肽，为非分泌蛋白；并定位在内质网，概率为0.820。PpCYP707A5蛋白的理论分子质量为54.1 kDa，理论等电点为9.03，不稳定系数为47.78，属于不稳定蛋白，分子式可写为C2481H3874N640O673S21，原子数7 689，带负电荷（Asp + Glu）氨基酸49，带正电荷（Arg + Lys）氨基酸59，脂溶系数为91.96，GRAVY为-0.089，是亲水性蛋白。在6～23位点含有一个由内向外的跨膜螺旋结构，8～27位点有一个由外向内的跨膜螺旋结构。与PpCYP707A4蛋白相同，也不含信号肽，为非分泌蛋白；定位在内质网，概率为0.820。

2.3蛋白结构预测采用Npsa-pbil、NetPhos 2.0 Server在线工具预测蛋白质二级结构、磷酸化位点。PpCYP707A4有243个氨基酸残基形成α-螺旋，32个形成β-螺旋，78个形成延伸链和132个形成无规则卷曲；有12个丝氨酸（serine，S）残基、7个苏氨酸残基（threonine，龙源期刊网 http://www.daodoc.com T），2个酪氨酸（tyrosine，Y）参与磷酸化过程。PpCYP707A5有226个氨基酸残基形成α-螺旋，27个形成β-螺旋，81个形成延伸链和140个形成无规则卷曲；有13个丝氨酸（serine，S）残基、6个苏氨酸残基（threonine，T），3个酪氨酸（tyrosine，Y）参与磷酸化过程。Swi-model预测蛋白三级结构，结果显示PpCYP707A4、PpCYP707A5蛋白的QMEAN4值分别为-5.67、-4.79，三级结构存在较大差异（图5）。

注：a.PpCYP707A4蛋白三级结构； b.PpCYP707A5蛋白三级结构。

图5预测的2个PpCYP707A蛋白三级结构3 讨论

休眠的长短决定落叶果树的地理分布，是落叶果树的重要性状之一[7]。我国梨的种质资源大体分为北方品种群和南方品种群，北方品种群的特点为抗寒力较强、休眠期较长，南方品种群表现出早熟、休眠期短等优势[8]。„黄花梨‟在福建省建宁县能够正常开花结果，产量较大，而在纬度较低的福建省上杭县其萌芽不整齐的现象明显，休眠期的长短对于„黄花梨‟的产量和栽培具有重要的制约作用，休眠影响梨品种的选育和梨产业的发展，研究梨的休眠意义重大。对桃[3]、大樱桃[9-10]、欧洲甜樱桃[11]、葡萄[12]、牡丹[13]等的研究表明ABA的含量变化是影响木本植物芽休眠进程的重要因素。从分子水平探讨ABA调控梨花芽休眠进程的分子机制，将有利于构建梨休眠的调控网络，从而有助于梨品种的选育。

该研究从„黄花梨‟上分离到ABA分解途径关键酶基因PpCYP707A4和PpCYP707A5，采用生物信息学方法分析其核苷酸序列、氨基酸序列，构建相关系统发育树并预测蛋白结构。分析结果显示，PpCYP707A4与PpCYP707A5核苷酸序列和氨基酸序列相似度较高，为94.27%和94.96%，两者蛋白理化性质相近，符合家族基因的特点。系统进化树显示，„黄花梨‟的PpCYP707A4和PpCYP707A5与苹果的2个基因（XP_008346457.1、XP_008382035.1）分别单独聚类，而非PpCYP707A4和PpCYP707A5独自聚类。对苹果[14]、大豆[15]、剑兰[16]的研究结果也显示CYP707A家族基因在系统发育树并未单独聚为一类而是分散到几类中。梨基因组数据发表后，Wu等[17]认为蔷薇科的染色体是由祖先7个染色体发展形成的，梨和苹果基因组之间具有高共线性。该研究克隆的2个基因很可能产生于梨和苹果的共同祖先，而后遗传给梨和苹果。CYP707A是一个多基因家族，它们在不同组织中的转录模式不同[2]，以功能交迭的方式参与环境胁迫应答[4，18-19]、休眠解除[20]等不同的生理反应过程，共同调控植物体内源ABA的分解。因而，需进一步研究该基因家族各基因的特性，研究它们的生物学功能，为开展„黄花梨‟花芽休眠的研究提供信息，为短低温梨品种的选育奠定基础。

参考文献

[1] 廖光升.黄花梨低温需冷量研究[J].落叶果树，2010（1）： 4.[2] 许智宏，薛红卫.植物激素作用的分子机理[M].上海： 上海科学技术出版社，2012： 67-69.龙源期刊网 http://www.daodoc.com [3] 王海波，高东升，王孝娣，等.赤霉素和脱落酸与桃芽自然休眠诱导[J].果树学报，2006，23（4）： 599-601.[4] SAITO S，HIRAI N，MATSUMOTO C，et al.Arabidopsis CYP707As encode（+）-abscisic acid 8′-hydroxylase，a key enzyme in the oxidative catabolism of abscisic acid[J].Plant Physiology，2004，134（4）： 1439-1449.[5] NAMBARA E，MARION-POLL A.Abscisic acid biosynthesis and catabolism[J].Annu Rev Plant Biol，2005，56： 165-185.[6] KUSHIRO T，OKAMOTO M，NAKABAYASHI K，et al.The Arabidopsis cytochrome P450 CYP707A encodes ABA 8′‐hydroxylases： key enzymes in ABA catabolism[J].The EMBO Journal，2004，23（7）： 1647-1656.[7] 王海波，高东升，王孝娣，等.落叶果树芽自然休眠诱导的研究进展[J].果树学报，2006，23（1）： 91-95.龙源期刊网 http://www.daodoc.com

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