四川大学生物制药技术复习资料_生物制药工艺复习资料

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生物制药技术复习资料

一、生物药物生产原料选择的主要原则。生物药物的特性及种类。

主要原则：有效成分含量高，原料新鲜；来源丰富，易得；原料产地较近；杂技含量少；原料成本低；易提取。特性：（1）药理学特性：治疗的针对性强；药理学活性高；毒副作用小，营养价值高；生理副作用常有发生。（2）生产、制备中的特殊性：原料中的有效物质含量低；稳定性差；易腐败；注射用药有特殊要求。（3）检验上的特殊性：要有理化检验指标，和生物活性检验指标。分类：

按药物化学本质和化学特性分类：（1）氨基酸及基衍生物类（2）多肽和蛋白质类（3）酶和辅酶类（4）核酸及基降解物和衍生物类（5）糖类（6）脂类（7）细胞生长因子类（8）生物制品类（9）小动物制剂（10）动物器官或组织制剂

按原料来源分类：（1）人体组织（2）动物组织（3）植物组织（4）微生物（5）海洋生物来源的药物

按生理功能和用途分类：（1）治疗药物（2）预防药物（3）诊断药物（4）其他

二、生物药物提取分离制备方法的工艺过程。在对生物药物进行提取操作时，选择提取试剂需注意的问题。

工艺流程：

1、生物药物原料的选择、预处理与保存

2、生物药物的提取：（1）生物组织与细胞破碎：磨切法，压力法，反复冻融法，超声波震荡破碎法，自溶法，酶溶法（2）选择合适的溶剂进行提取

3、生物药物的分享纯化：（1）蛋白质类药物的分享纯化：沉淀法，亲和层析法，疏水层析法（2）核酸类药物的分离纯化：提取法，发酵法（3）糖类：沉淀法，离子交换层析法（4）脂类：沉淀法，吸附层析法，离子交换层析法（5）氨基酸类：沉淀法，吸附法，离子交换法

试剂的选择：

1、对所需要提取的活性成分溶出度较高，对杂技较低。

2、不破坏活性成分。

3、利于后续预处理。

4、对环境影响较小，有利于回收和处理。

5、对设备要求不高。

6、成本较低。

7、对人体无害

三、基因工程制药的主要工艺过程

获得目的基因，组建重组质粒，构建基因工程菌（或细胞），培养工程菌，产物的分离纯化，质量控制，产品检验包装

四、目的基因及其获取方法和要求，构建cDNA文库法分离目的基因主要步骤。

获取方法：构建基因文库法，构建cDNA文库法，DNA的化学合成法，PCR法，反转录法 要求：不含多余干扰成分，纯度高，片段大小适合重组操作

主要步骤：选择分享表达目的基因的组织或细胞，制备总体RNA和mRNA-cDNA第一链和第二链的酶促合成和分级分离，与各种接头连接并克隆到载体，包装及转染宿主菌，在培养基上生长繁殖成重组菌落或噬菌斑，筛选出含有目的基因的克隆，cDNA文库的质量检测及保存

五、基因工程菌的培养方式，连续式发酵对基因工程产品大规模生产的优势。影响基因工程菌发酵的主要因素有哪些？如何进行基因工程菌发酵条件的研究。

培养方式：分批培养，补料分批培养，连续培养，透析培养，固定化培养/ 5

连续培养优势：

1、可为微生物提供恒定的生长环境，控制其比生长速率，2、可实现将工程菌的生长阶段和基因表达阶段分开进行两阶段连续培养，并可通过优化速率水平，稀释率和比生长速率这三个参数，保证在第一阶段培养时质粒稳定，在第二阶段获得最高表达水平或最大产率。

影响基因工程菌发酵的主要因素：

1、培养基的影响。

2、接种量的影响。

3、温度的影响。

4、溶解氧的影响。

5、诱导时机的影响。

6、诱导表达程序的影响。

7、pH的影响

研究内容：

1、选择宿主菌：研究不同宿主菌对外源基因表达的影响

2、基因工程菌的生长曲线测定3发酵条件对外源基因表达的影响

4、重组质粒稳定性研究

六、以包涵体表达形式的基因工程药物的分离纯化过程和方法，分离纯化出具有活性的蛋白质的一般步骤及其操作要点。如何进行分离纯化的研究。过程方法及操作要点：

1、菌体细胞的收集与破碎（既要使菌体破碎率尽可能高，又要保持包涵体的完整性）

2、包涵体的分离，洗涤与溶解（通过离心法使包涵体与上清液中的碎片及杂质蛋白分开。包涵体的洗涤基本原则：杂质去除率尽可能高而不溶解包涵体中的目的蛋白。溶解包涵体的试剂选择基本原则：（1）对目的蛋白的溶解性强，选择性好，（2）保护蛋白质的生物活性（3）安全性（4）适合后续各种纯化操作（5）价廉）

3、变性蛋白的纯化（对包涵体抽提物采用柱层析、凝胶过滤、离子交换层析和HPLC等方法进一步分离纯化）

4、蛋白质的复性（恢复可溶性和生物活性，就考虑影响因素：蛋白质尝试，杂质含量，重折叠速度，氧化还原剂用量和比例，重折叠配体的掺入，温度，pH和离子强度等）分离纯化研究：

1、破菌研究：破菌方法及其条件研究，镜检评价其破碎效果，原则是使菌体破碎率尽可能高，又要保持包涵体的完整性

2、包涵体的分离和洗涤研究：（1）分离包涵体时的离心力和时间的考察，（2）洗涤剂及其他浓度，用量研究（3）洗涤时间和温度研究

3、目的蛋白的变性（抽提）研究：（1）变性剂及其浓度、用量的研究（2）变性操作时间和温度研究（3）变性操作后的固液分离研究。

4、变性蛋白的纯化研究：对包涵体抽提物可采取柱层析，凝胶过滤，离子交换层析和HPLC等方法进一步分离纯化。

5、变性蛋白的复必研究：考察比较不同复性方法对目的蛋白复性效果的影响。

6、目的蛋白的高度纯化研究：对经复性后得到的目的蛋白进行进一步高度纯化，以满足不同的需要。

七、基因工程药物质量控制的必要性及其质控要点，基因工程药物最终产品的质量控制特点及要点。必要性：

1、它是利用获得细胞作为表达系统来制备产品，所获得的蛋白质往往分子量较大，并且具复杂的表达结构

2、许多基因工程药物都是参与人休一些生理功能精密的蛋白质，在极微量的差别的情况下产生显著效应

3、宿主细胞中表达的外源基因在翻译，转录及工艺放大的过程中会产生变化、质控要点：

1、原料的质量控制。

2、生产的质量控制。

3、最终产品的质量控制

质控特点：任何单一的分析方法都无法满足对该类产品的检测要求，它需要综合生物化学，/ 5

免疫学，微生物学，细胞生物学和分子生物学等多门学科的理论和技术，才能切实保证基因工程产品的安全有效。

八、目的基因高效率表达的方式，全面提高目的基因表达水平的措施和方法。表达方式：

1、目的基因的不溶性高效表达：包涵体形式。

2、目的基因的可溶性高效表达：直接得到有生物活性的目的蛋白；

3、目的基因的高效分泌表达： 措施：

提高目的基因表达水平的措施(上游阶段)1.对基因工程宿主菌进行改造。2.选择能高密度表达的宿主菌。3.选择能提高目的蛋白表达质量的宿主菌

提高目的基因表达水平的措施(下游阶段)1.提高工程菌的质粒稳定性。2.对重组菌进行高密度培养。3.减少乙酸等抑制性副产物的形成。4.选择能提高目的蛋白表达质量的方法

九、酶工程制药的主要内容

1、药用酶的生产：发酵生产，分离纯化，分子修饰

2、酶法制药：酶催化反应、固定化、非水相催化

十、酶法制药研究中涉及到的研究项目及内容

1、原料的选择及反应的研究。

2、酶或酶系的选择研究。

3、酶催化反应最佳工艺条件研究。

4、产物的分离纯化研究

十一、植物细胞的生理特性，植物细胞培养的基本流程和技术。生理特性：

1、比微生物细胞大得多；

2、具有群体生长特性，单细胞难以生长，繁殖；

3、对剪切力敏感，抗张力强度大，抗剪切力小；

4、生长速度慢，操作周期长；

5、容易结成细胞团；

6、大多植物细胞的生长及次级代谢物的生产都要求一定的光照和时间，且不同波长的光具有不同的效果

基本流程：

1、外植体的获得及预处理；

2、获得悬浮细胞株

3、悬浮细胞株筛选

4、植物细胞的扩大培养；

5、大规模培养 基本技术：

1、植物细胞的获得技术；

2、植物细胞的选育与改良技术；

3、植物细胞培养技术；

4、植物细胞培养次级代谢产物技术；

5、植物细胞培养生物转化技术

十二、植物细胞获取的主要方法及其操作过程

主要方法：从外植体直接分离，组织诱导获取，原生质体再生 操作过程：

1、外植体的选择与预处理

2、直接分离：（1）机械捣碎法：先将外植体轻轻捣碎，然后通过过滤和离心分离细胞（2）酶解法：利用果胶酶，纤维素酶等处理，分离出具有代谢活性的细胞

3、愈伤组织诱导法：（1）诱导培养基的制备（2）外植体植入诱导培养基中培养生成愈伤组织（3）愈伤组织继代培养

十三、植物细胞培养中提高植物次生代谢物生产的途径。

1、添加诱导因子；

2、前体饲喂：在植物细胞培养中加入次生代谢物合成的前体物质；

3、两相法培养；

4、培养条件的控制；

5、在培养基中添加代谢产物合成抵制剂；

6、其他，如选育高产细胞株，二步法培养，新型生物反应器等

十四、植物细胞培养制药的培养方法。愈伤组织培养的基本过程和操作/ 5

培养方法：

按培养对象分：愈伤组织培养，原生质体培养，小细胞团培养 按培养基类型分：固体培养，液体培养

按培养方式：悬浮细胞培养，固定化细胞培养 基本操作和过程：

1、愈伤组织培养基的配制；

2、愈伤组织的选择；

3、接种；

4、培养

十五、植物细胞培养次级代谢物生产的基本工艺过程，如何对植物细胞培养次级代谢物生产制药及植物细胞培养生物转化制药进行研究 工艺过程：

1、外植体的选择与处理；

2、植物细胞的获得；

3、植物细胞的扩大培养；

4、植物细胞悬浮培养；

5、次级代谢物的分离纯化 研究的内容：

1、外植体的选择和处理研究；

2、愈伤组织诱导；

3、植物细胞的诱变、筛选；

4、细胞悬浮培养的研究；

5、提取分离与纯化方法研究

十六、动物细胞的生理特点，生产用动物细胞的种类及其特点，工程细胞库的种类及要求，细胞的冷冻保存与复苏技术及其操作要领

生理特点：

1、动物细胞的分裂周期长；

2、细胞生长需贴附于基质，并有接触抑制现象；

3、正常二倍体细胞的生长寿命有限；

4、对环境敏感；

5、对培养基要求高；

6、蛋白质的合成途径和修饰功能与细菌不同 细胞种类及特点：

1、原代细胞：增殖能力有限，需大量动物

2、二倍体细胞体：传代寿命有限，具有明显的贴壁依赖和接触抑制特点，无致癌性

3、转化细胞系：具有无限繁殖超额能力，倍增时间较短，对培养条件和生长因子要求较低

4、融合细胞系：杂交特性

5、重组工程细胞系

工程细胞库的种类及要求：

1、原始细胞库（MCB）:储存于MCB的细胞应该是单一来源的均质细胞，对二倍体细胞应该是群体倍增水平尽可能低的细胞。储存时需有该细胞的详细档案，包括该细胞系的历史，我和对各种有害因子的检查结果

2、生产用细胞（MWCB）储存于MWCB的细胞应该是从MCB来的，或从单一安瓿来，或从多个安瓿在融化即刻混合在一起的然后经培养扩增达一定数量后，再分装储存形成的细胞库。该细胞库同样需要建档案，而且需进行无菌性的无细胞交叉污染的检查 细胞的冷冻保存与复苏技术及其操作要领：

常用技术是液氮冷冻保存法，主要采用加入适量保护剂的缓慢冷冻法保存细胞。步骤：细胞悬液制备，加保护剂，分装和封口，液氮冻存。

复苏一般采用快速融化法，以保证细胞外结晶快速融化，以避免慢速融化水分渗入细胞内，再次形成胞内结晶损伤细胞。

十七、动物细胞体外培养的生长与增殖过程，动物细胞与微生物细胞和植物细胞在培养上的区别，动物细胞培养的方法和操作方式及其特点 生长与增殖过程：原代培养期，传代培养期，衰退期

培养区别：

1、动物细胞无细胞壁，且大多哺乳动物细胞附着在固体或半固体的表面才能生长

2、对营养要求严格，除氨基酸，维生素，盐类，葡萄糖或半乳糖外，还需要血清

3、动物细胞对环境敏感，包括pH，溶氧，温度，剪切应力都比微生物有更晋严的要求，/ 5

培养方法及特点：

1、悬浮培养：适用于一切各类的悬浮细胞和兼性贴壁细胞。优点：操作简便，培养条件较均一，传质和传氧较好，容易扩大规模培养。缺点：较难采用灌流培养，细胞密度一般较低

2、贴壁培养：适用于一切贴壁细胞和兼性贴壁细胞。优点：适用的细胞各类广，较易采用灌流培养，细胞密度高，缺点：操作比较麻烦，需要合适的贴附材料和足够的面积，培养条件不均一，传质和传氧较差。

3、贴壁－悬浮培养：将悬浮培养和贴壁培养两者结合，优势互补，主要方法有：微载体培养，包埋和微囊培养，结团培养。操作方法及特点：

1、分批式操作：细胞和培养基一次性加入反应器进行培养

2、流加式操作：不断加入营养成分而不取出条件培养基

3、半连续式操作：每隔一段时间取出部分培养物，补充同样数量新鲜培养基

4、连续式操作：连续地加入新鲜培养基，同时等速地取出反应器内的培养液（包括细胞）

5、灌流式操作：不断取出部分条件培养基（无细胞），补充等量新鲜培养基

十八、动物细胞培养制药的基本工艺过程。目前用哺乳动物细胞大规模培养生产蛋白工业化过程的主要通用技术平台及其特点

动物细胞－捣碎－组织碎片－酶处理－单个细胞－离心收集细胞－营养培养－培养瓶培养－消化处理－接种－扩大培养－种子细胞液氮保存－取出细胞种子－种子解冻复活培养－扩大培养－接种－大规模培养－产物分离纯化－产品 技术平台及特点：

主要是以搅拌式生物反应器悬浮培养（70％以上）作为通用技术平台, 平台工艺的特点是采用无血清培养（50％以上）和成熟的流加和灌流工艺。

悬浮培养工艺中影响细胞生产数量和质量的因素,主要应考虑细胞培养环境(营养条件、产物积累、pH、温度和渗透压),终产物(乳酸和氨)毒性累积和必需营养物的添加等。设计适应细胞生长的无血清培养基,控制营养物的添加,减少产物消耗积累是解决问题的有效手段。对于搅拌的剪切损害可通过反应器的优化被减少, 另外在培养液中添加剪切保护剂。贴壁细胞生产工艺,最佳的生物反应器形式是搅拌式微载体悬浮培养系统,并可提供最有效的优化工艺和最适宜的流加工艺设计。最佳的工艺设计是高密度连续灌流培养。流加培养和灌流培养是动物细胞培养工艺中最常用的两种操作方式/ 5