大鼠脑挫伤后脑组织β_口腔颌面部软组织挫伤

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【摘要】目的 观察大鼠实验性脑挫伤后cns内b—app蛋白表达时空性规律。方法 采用自由落体撞击法致大鼠脑挫

伤模型，用免疫组化技术观察伤后b—app蛋白在不同时间(0．5 h、2 h、6 h、12 h、24 h、3 d、7 d、14 d)的表达情况，并用计算机

图像分析技术作定量统计分析。结果(1)皮质内b—app蛋

白在伤后表达呈一定波动性，0．5 h表达明显增加后，逐渐下降，h降至最低，低于对照组，随后再次表达增加，3 d达高峰；(2)伤后24h海马区b一-app表达开始逐渐下降，3 d降至最低，1

4d回到对照组水平；(3)齿状回(dg)内b—app蛋白在伤后12 h低于对照组。结论实验性脑挫伤后皮质b—app表达时序性

规律可为脑损伤时间推断提供一个新的参考指标，但海马区及dg13-一app变化规律在脑损伤时间推断方面价值不大。

【关键词】脑挫伤；b淀粉样前体蛋白；损伤时间；免疫组织化学；法医病理学

【中图分类号】d919．1

【文献标识码】a

【文章编号】1007一-9297(2006)02—01 15—04

a study on [3-app expreion in experimental brain contusion in rats．he guanglong, zhou yiwu, sa dongmei, et o1．

departerment offorensic pathology,tonal medical college，hust,wuhan 430030

【abstract】obj~five to study the change of13-app expreion in diferent wound age and site in the experimental traumatic

brain injury in rats．methods the animal model of cerebral contusion was established by impact to the parietal lobe with a free fall

weight,b—app expreion in different wound age was observed with immunohistoehemistry． the results were measured

quantitatively with computer imaging analysis system．male spragure-dawley rats were divided into 3 groups：normal control，sham

operation control and injury group．results(1)th e number of13一app—positive neurons definitely increase in 0．5 h after brain injury．

decline gradually and reach valley bottom in 1213,，increase again and reach the peak in 3 d．(2)in hippoeampus the number of —

app—positive neurons definitely increases after 24 h after brain injury，then dechne gradually and reach valley bottom in 3d．return

to the level of control at 14 d．1,3)in dentate gyms fdg1 the number of i3-app—positive neurons at 12 h is lower than the control

after brain injury． i11e intensity of the immunoreaefivity ofp—app protein changes with time after traumatic brain injury．which might

be used for determ ing injury time．，however．，the change in hippoeampus and dg has little value in determing injury time．

【key words】cerebral contusion，3-app，injury time，immunohistochemistry，forensic pathology

近年来很多研究发现，一些神经系统的损伤，如

创伤、感染、中毒、轴索损伤及缺血等，均可影响b淀

粉样前体蛋白(beta一．amyloid precursor prot, in,p—

app)表达，国内外已有大量文献报道，但主要集中于

dai和脑缺血后损伤的研究，少见关于脑挫伤方面报

道。为此，我们应用b—app免疫组织化学技术，观察大

鼠实验性脑挫伤后在皮质和海马区表达情况。

材料与方法

一、实验动物分组和脑损伤模型制备

44只健康sd大鼠，雌雄不限，体重300±50 g(由

同济医学院实验动物中心提供1，随机分成正常对照组

(2只)、假性手术组(2只)及脑损伤组(伤后0．5 h、2 h、6h、12h、24h、3 d、7 d、14d、共8组，每组5只)按照

参考文献[1】的方法，利用自由落体装置致大鼠脑挫伤

模型。

二、组织及切片处理

大鼠腹腔麻醉后，经4％多聚甲醛溶液经心脏灌

注固定后取出整个脑组织，沿挫伤灶中央作冠状切面

取材，石蜡包埋

免疫组织化学sp法按试剂盒f北京中山公司1说

【作者简介]何光龙(1978一)，福建平潭人，硕士，主要从事法医病理学方面的研究。teh 0***；e-mail：hg12001@163． net

[通讯作者]周亦武(1964一)，男，博士，教授；研究方向法医颅脑损伤、猝死病理及法医毒理学。tel：+86一-27—83657925；e-mail：yiwuh~j—

di遁~sina．com

[基金项目]国家自然科学基金(30570629)；中国博士后科学研究基金(2o03034459)；湖北省自然科学基金(2o03aba140)

· 116 ·

明书进行，一抗为兔抗大鼠b—app多克隆抗体(武汉

博士德公司)，工作浓度为1：70，以pbs替代一抗作为

阴性对照，dab(~l京中山公司1显色，苏木素复染细胞

核。

三、图像分析与统计学处理

在b—app免疫组化染色切片的顶叶皮层挫伤灶

周围、海马区及dg，各取5个视野(6708．9 rrf)，应用

hpias一1000全自动医学彩色图像分析系统测量每个

视野内p—app阳性细胞数(n)。用sas 8．0统计学软件

包对数据进行方差分析，随机组间用snk检验进行显

著性比较。

结果

法律与医学杂志2006年第13卷(第2期)

一、he染色组织病理学改变

伤后6 h内挫伤灶周围小血管及毛细血管扩张、淤血．组织水肿：神经元和胶质细胞肿胀，胞核着色浅

淡．部分神经元核深染。伤后12 h～24 h，挫伤灶周围

神经元肿胀，尼氏体消失，胞浆呈嗜伊红染色，星形胶

质细胞(astrocyte，ast1肿胀；可见白细胞附壁和游出，挫伤区散在分布少量中性粒细胞和巨噬细胞。伤后

3d，挫伤灶内神经元消失，其周围出现少量泡沫细胞及

核大而深染的ast；伤后7 d挫伤灶形成软化灶，并见

大量泡沫细胞；伤后14 d挫伤区形成囊状包裹。

对照组海马区锥体细胞层及dg颗粒细胞层细胞

排列整齐、密集。伤后海马神经元肿胀，胞浆呈淡红

照片

1、照片3·、照片5 分别是对照组脑皮质、ca1、齿状回[3-app免疫组化；照片2 实验性脑挫伤3d后脑皮质b—app免疫

组化；照片4 实验性脑挫伤3d后海马cal j3一app免疫组化；照片6 实验性脑挫伤12h后齿状回~

app免疫组化：。

ph0t01、photo3、pho~5 immunostaini“g。f[3-app in control c。rtex, ca 1 and dg．ph0t02．immunostaining。f[3-app in c。rtex

3d y after the xperimental traumatic brain injury．photo4．immunostaining of[3-app in ca 1 0f hippocampus 3 days after the e

xperimen．

tal raumatic brain injury·photo6·immunostaining of 13-app in dg 12 hours after the experimenta1 traumatjc brajn jniury

．

法律与医学杂志2006年第l3卷(第2期)

表1 脑挫伤周围、海马区及dg 免疫组化染色图像分析结果

table 1．the number of 13-app positive cells around the contusion site，hippocampus and dg

· ll7 ·

色。细胞核固缩深染。随伤后存活时间延长，神经元嗜

酸性变。尼氏体消失。神经数目减少。锥体细胞层细胞

不完整，细胞胞体缩小。

二、13一app免疫组织化学染色结果

对照组脑皮质13一app见于部分ast及神经细胞

内(照片1)；伤后0．5 h b—app阳性细胞数较对照组

明显增多。挫伤灶周围的神经元及ast内出现棕色颗

粒，颗粒分布于胞浆及核周体。呈戒指环状，阳性细胞

呈椭圆形或圆形，突触未见染色：伤后2 h一12 h阳性

细胞数逐渐减少且染色减淡。12 h后挫伤灶周围神经

元b—app表达再度增强，3 d组挫伤灶周围大量神经

元及ast内出现深棕色颗粒f照片21。远离挫伤灶皮

质部分神经元及多数ast也出现阳性着色；随后逐渐

下降。14d组基本回到对照组水平。实验组不同时间

p—app免疫组化染色图像分析结果见表1，伤后b—

app阳性细胞数(n)变化具有一定波动性。0．5 h和3 d

分别达到波峰，而12 h在波谷。0．5 h、12 h和3 d组的n与对照组比较差异均有显著性意义(p

对照组海马区锥体细胞内已有大量b—app蛋白，阳性细胞被染色成深棕色，多呈戒指环样(照片3)；伤

后24 h海马区锥体细胞层阳性着色开始减淡，阳性细

胞数减少；3 d组海马区部分神经元细胞质中淡棕色

颗粒，并可见细胞核皱缩(照片4)；14 d组基本回到正

常组水平。海马区b—app免疫组化染色图像分析结果

见表1。海马区3 d组的n与对照组比较差异有显著

性意义(p

2对照组dg颗粒细胞层内有大量b—app蛋白表

达(照片51，伤后仅在12h组见免疫强度减弱(照片

6)。dg b—app免疫组化染色图像分析结果见表1。

12h组与对照组比较差异有显著性意义(p

3注：1)与对照组比较：p

p

5皮质

会 35

医 5

o

．

q

pit

十皮质

图1 皮质挫伤周围b_app阳性细胞数(n)随时间变化曲线

fig 1 the number of ib-app-po sitive cells and time

relationship in codex

4035

匿 5

o

海马区

q

pit

图2海马区b_app阳性细胞数(n)随时间变化曲线

fig 2 the number of 3-app——positive cells and time

relationship in hippocampus

讨论

p—app是一种具有受体样结构的大分子膜整合糖蛋白，相对分子量约为110 130 kd。它包括膜外较

长的氨基端、较短的跨膜区和胞内羧基端。细胞外功

· 118 ·

150

蓄 o

蒌50

0

齿状回

十齿状回

图3 齿状回b_app阳性细胞数(n)随时间变化曲线

fig 3 the number of 15-app-positive cells and time

relationship in dg

能区与kunitz蛋白酶抑制剂(kpi)具有高度同源性。b—

app可在人体大多数细胞中表达，普遍存在于血液和

脑脊液中。b—app基因定位于人染色体21q21．2。通过

选性剪切，可形成至少8种长度不等的b—app异构

体，其中以app695、app714、app710较为常见。afy751、app770皆含有kpi功能区。[21 app659在神经元特

意表达。app770主要见于ad患者，其他异构体则广

泛表达。对b—app的生理功能尚不完全清楚，正常情

况下广泛表达于大多数细胞，以神经元和星形胶质细

胞中含量较丰富，主要经非淀粉样蛋白生成途径水

解，促进神经细胞生长分化、增加神经突触的可塑性、参与信号转导、促进细胞黏附、神经保护作用。[31脑挫

伤后b—app参与对损伤的神经元进行修复。

国内外已有部分学者在dia实验模型中探讨伤

后b—app的表达情况。陈晓刚等[41发现，早在伤后0．

5h b—app蛋白表达就开始增加，且表达呈一定的波动

性。也有学者发现伤后b—app在3 h呈明显阳性表

达，1 d达到高峰，3 d后逐渐减弱，14 d基本恢复正

常。[51 murakami等[61用蛋白印迹分析显示，弥漫性轴索

损伤后29 h，b—app蛋白表达增加，免疫组化结果显

示皮质在伤后24 h～7 d b—app表达显著增加，海

马区b—app在伤后24 h～3 d积聚于ca3区。有人在沙鼠短暂性前脑缺血模型中发现，伤后24h海马ca

1区b—app免疫标记的神经元数量减少，2 d后又突然

表达增加，7 d又减少。陈艳昕等181在人脑缺血的海

马中研究发现，b—app在缺血2 h～6 h组表达明显，4d组达高峰，4d以后下降，但仍高于对照组。

本研究发现，正常脑组织部分神经元和ast表达

b—app蛋白，且主要集中于细胞核内，这主要是其对

法律与医学杂志2006年第13卷(第2期)

神经系统的稳定和维护起作用。伤后0．5 h13一app蛋白

表达显著性增强，这表明p—app作为一种快速反应蛋

白．在损伤后被诱导升高，可能是对脑的保护。伤后

2h～12 h13一app蛋白表达降低，具体机制不详，可能为

脑挫伤后神经元坏死，而使蛋白合成能力降低，这一

时期的神经元变性、坏死也可从he染色中得到验证。

伤后12 h b—app表达突然升高并于3 d达到高峰。

伤后皮质b—app蛋白表达呈波动性，与一些文献报道

【 不同，考虑为采用的实验模型不同。本次实验首次

利用脑挫伤模型探讨b—app蛋白表达的情况，结果显

示伤后b—app蛋白表达时序性规律，可望作为法医学

上推断脑损伤时间的客观指标之一。

作者对脑挫伤后大鼠海马区及dg研究中发现，正常大鼠海马区及dg内已有大量b—app蛋白表达，伤后表达的变化不明显，分别仅在3 d和12 h组内表

达显著低于对照组。这结果表明在脑挫损伤后，海马

结构内b—app蛋白在脑挫伤中变化不明显，具体作用

不明确。其表达情况，对在法医脑损伤上的应用价值

意义不大

综上所述，通过本研究发现脑损伤后b—app蛋白

表达存在一定时序性规律，可望作为法医学上推断脑

损伤时间的客观指标之一。

参考文献

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(收稿：2005—12—0l；修回：2006—03—11)