病理检验技术_病理学检验技术
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荧光原位杂交 FISH 用DNA探针与组织切片上互补的DNA杂交，通过观察荧光信号在染色体上的位置和颜色来反映相应基因的情况。
第一章 病理检验技术概述
病理学的作用：
1、研究疾病的病因、发病机制，认识
疾病的发生发展规律
2、为临床诊断疾病、治疗疾病、分析预
后提供依据等。
病理检验的定义：
------在临床医疗实践中，通过对患者病变组织或细胞进行检查，以协助临床诊断疾病的方法称为病理检验。
一、病理检验的主要任务
（一）确定疾病的诊断
（二）为临床选择治疗方案提供依据
（三）提供有关预后因素的信息。（最正确、最可靠、最后的诊断）
（四）了解疾病的发展及分析疗效
（五）为科学研究积累资料
（六）为提高临床诊断水平服务
二、病理检验分类
（一）细胞学检验（脱落细胞、细针穿刺吸取）
（二）组织学检验---最后的诊断
活体组织检验、手术标本检验、手术中病理检验
（三）尸体剖验
病理学技术：
在病理学临床及科学研究工作中使用的各种技术方法统称为病理学技术。病理检验技术的质量和水平是临床病理诊断工作中至关重要的因素。“技术是病理学之母。”
第二节、病理检验技术常规工作 收发工作
协助取材和尸体剖检工作 制作制作切片及细胞学涂片 病理资料管理及检索
药品、物资的管理及仪器维护 大体标本的收集和制作
第六章 组织制片技术 P39 常规石蜡切片制作程序 组织固定→取材→固定→脱水→透明→浸蜡→包埋→切片→染色→封片→观察
第一节 组织块的处理
（一）组织切片制作过程中的各种操作：
1、取材与固定：合理取材、及时固定；
2、洗涤、脱水、透明；
4、浸蜡、包埋；
5、切片、贴片（展片、捞片）和染色：
6、封片：长期保存。
一、取材：
-------按照病理检查的目的和要求，切取适当大小和数量的组织块，用于制作组织切片的过程。
注意事项：
部位、大小、形状、方向
二、固定和固定液
生理盐水或10%甲醛。
固定：将组织浸入某些化学试剂，使
4、蒸汽固定法：为了固定组织中可溶性物组织细胞内的物质尽量保持在生活状态时质、的形态结构和位置过程。
血液、细胞涂片等；
（一）固定目的：
（三）固定液的特性：
（1）防止组织、细胞的自溶与腐败；
1、渗透力强，迅速渗入组织内部
（2）凝固或沉淀细胞内物质；
2、不会使组织过度收缩或膨胀
（3）增加组织硬度，便于制片；
3、能硬化组织，保持细胞形态和位置
（4）产生不同的折光率，有利于染色后观
4、使组织对染料产生亲和力，产生折光率 察辨认。
（四）组织固定注意事项：
（二）固 定 方 法：
1、及时固定
1、浸泡固定法：病理外检一般均用此法；
2、固定容器宜大
2、注射、灌注法：体积过大或整个脏器或
3、固定液应足量：固定组织体积的10-20尸体的固定； 倍
3、微波固定法：应用于临床病理快速诊断，4、防止组织变形 微波固定组织温度至关重要。微波固定介质
5、确定恰当的固定时间 可用
（五）组织固定液 常用固定液：
1、4%甲醛（福尔马林）：配置为市售的40%甲醛1份加水9份混合即成；
2、酒精（乙醇）：高浓度组织硬化显著，先用80%固定数小时，再用95%固定；
3、中性缓冲甲醛液：可提高免疫组化阳性率。
4、酒精-甲醛液（A-F固定液）：
5、Zenker固定液： 1、4%甲醛（福尔马林）：
久置能产生白色沉淀（三聚甲醛），容易氧化变成甲酸，严重影响细胞核着色。固定陈旧多血脏器如肝脾，易产生黑色色素，叫甲醛色素。
2、酒精（乙醇）：
高浓度组织硬化显著，先用80%固定数小时，再用95%固定；
50%以上浓度的乙醇可溶解脂肪和类脂质，也可以溶解血色素和损害其他色素。
中性甲醛液
配置：40%甲醛150-200ml，蒸馏水800-850ml，磷酸二氢钠4g，磷酸氢二钠13g。常用的固定液或标本保存液，是免疫组化最常用的固定液。
选择性固定液：
1、丙酮：广泛用于组织化学中酶的固定；
2、戊二醛固定液：广泛用于电镜标本的固定，应采用缓冲液配制固定液
3、醋酸：不能保存糖，也不能固定脂肪及类脂，5%醋酸pH2～3可抑制细菌和酶的活性；
4、苦味酸：强酸，易燃易爆，酒精溶液可固定糖类；
5、氯化汞：只宜固定薄片组织，2mm～3mm厚的组织需固定6～18小时；
6、重铬酸钾：固定高尔基体、线粒体，对酸性染料着色良好；
7、锇酸：浓度为1%～2%水溶液用于电镜制片；
骨组织脱钙液：
在脱钙前，先将骨或钙化组织锯成4mm～5mm厚的簿片，按常规充分固定，然后进行脱钙。
组织脱钙的方法及应用：
（一）酸性溶液脱钙：
1、脱钙液配制：
（1）5%～10%硝酸水溶液：浓硝酸5ml～10ml，蒸馏水加至100ml；（2）硝酸甲醛液：浓硝酸10ml，10%福尔马林90ml；
（3）Schridde液：浓硝酸20ml，10%福尔马林100ml。对组织无明显损害，迅速、安全；（4）5%～10%甲酸水溶液：甲酸5ml～10ml，蒸馏水加至100ml（5）甲酸酒精液：脱钙速度较硝酸慢，但破坏组织也轻。（6）Plank-Rychlo液：脱钙比5%硝酸液快3倍。
Jenkins混合酸脱钙液、盐酸氯化钠液、枸橼酸钠、甲酸脱钙液等
2、脱钙方法：骨片悬于脱钙液中，敞开瓶口，每日更换一次新液，最好早晚各一次。
（二）螯合剂脱钙：速度很慢，但对组织成分几乎没有损害。用于免疫组化染色较理想。
1、脱钙液配制：取乙二胺四乙酸二钠（EDTA）25g，溶解于200ml蒸馏水中，氢氧化钠（NaOH）调整pH至7.0（大约加2.5g NaOH）。EDTA与钙可形成一种可溶性非离子化的复合物。
2、脱钙法：将骨片浸入脱钙液中，每周更换一次新液。一般致密骨脱钙需要6～8周，含有少量骨渣的组织约需一周。
（三）电解脱钙法： 此法即在脱钙液中通过电流，电解加速脱钙。
1、电解脱钙液配制：
25%盐酸50ml，25%甲酸200ml，蒸馏水750ml；
2、脱钙方法：直径30cm电解槽内盛大量电解液，将骨组织放在一个四周多孔的塑料小容器内放入电解液内，此容器通入白金丝或钨丝作阳极，在电解液内再放一白金丝或钨丝作阴极，通入6V直流电，电流强度1A～2A，调节两电极的距离来控制。电解液温度不超30℃～45℃，一般2～6小时即可脱尽。
脱钙后的处理
1、脱钙后的组织经流水冲洗4～12小时，除去残留的脱钙剂；
2、修去锯面的薄层组织，切成适当大小的组织块，进行常规脱水、透明、浸蜡及包埋；
3、用酸性液脱钙后的组织，苏木素染色时间应适当延长，在伊红中的时间应该缩短；
4、脱钙后组织切片在染色中较易脱落，充分烤片，染色前滴加2%～5%的火棉胶液，以使之粘贴牢固。
三、洗涤、脱水、透明
（一）组织的洗涤
1、洗涤的目的：防止组织中留有较多的固定液而影响脱水剂；
2、洗涤的方法：
（1）固定剂以水配制者：常用的固定剂是甲醛溶液（10%福尔马林溶液），用流水冲洗。大组织冲洗24小时，小组织冲洗2～4小时。
（2）固定剂含酒精者：一般不用冲洗，如需要冲洗必须用与固定剂中的酒精浓度相近或略低的酒精冲洗。
（二）组 织 脱 水
1、脱水的目的及原则：用某些溶剂逐渐将组织内吸收的水分置换出来，以利于透明剂和石蜡或火棉胶的渗入。
2、脱水剂的种类及特征：
特征：能与水在任何比例下混合；能与透明剂在任何比例下混合；
单纯脱水剂：脱水后再经二甲苯透明才浸蜡；
酒精：最常见的脱水剂。脱水能力强，但易使组织收缩、脆。
单纯脱水剂：脱水后再经二甲苯透明才浸蜡； 丙酮：脱水强，组织收缩严重，价格高。异丙醇：可代替无水酒精使用。价格贵。脱水兼透明剂：脱水后即可直接浸蜡。
正丁醇：为脱水剂兼有透明剂作用。用于植物标本的处理效果较好。叔丁醇：脱水兼透明。电镜标本制作时常用作中间脱水剂。
（三）组织透明或媒浸
目的是使石蜡能浸入组织块便于包埋。
1、二甲苯：最常用的透明剂，有毒、易挥发，透明力强，但组织易收缩变脆，小块组织以30分钟。
2、苯和甲苯：组织收缩小、不易变脆。
3、氯仿：即三氯甲烷。易发挥，透明力比二甲苯差，时间长，多用于大块组织的透明。
4、香柏油：为柏树树脂，收缩小，透明时间长，常用于染色后切片的透明。
四、组织浸蜡（透蜡）P48
（一）浸蜡的目的和方法：除去组织中的透明剂而代之以石蜡，以便切片。
（二）浸蜡剂的种类：
1、石蜡：经56℃～58℃石蜡浸蜡的组织包埋，有利于组织切片的连续性，对蜡块资料保存可靠，一般为3-4小时。
2、火棉胶：目前使用火棉胶浸入组织较少，多用于染色前的覆盖液。
3、碳蜡；
4、明胶。
五、组 织 包 埋 P49
（一）石蜡包埋法：为最常用的包埋法。
1、常规石蜡包埋法:包埋过程、包埋面的选择；
2、体液标本一般不做包埋和切片。
（二）快速石蜡包埋法：
1、操作过程：全程均加热，20～30分钟完成。（1）取材、固定：薄片1cmⅹ0.5cmⅹ0.3cm,在快速固定液（95%酒精、40%甲醛、冰醋酸）内加热煮沸1～2分钟。（2）脱水：组织厚度不超1.5mm，加入丙酮5 ～ 8ml，煮沸5～6分钟。（3）透明：加二甲苯加热1～2分钟。（4）包埋：石蜡包埋冰水冷却硬化。
3、碳蜡包埋法：即聚乙烯二醇。包埋熔点为38℃和52℃左右的分子量为1500和4000两种。适用于脂肪及脂类组织的制片。
4、明胶包埋法：
5、石蜡半薄切片包埋法：常根据组织类型进行脱水、透明和浸蜡。
6、树脂包埋法：适用于不脱钙骨髓活检组织、肝、肾穿刺活检和淋巴结组织等。
第二节 切片器具与切片
一、切片机：制作组织切片的主要仪器设备。
（一）切片机的种类及使用：
1、石蜡切片机：能将石蜡包埋的组织切出一定厚薄的切片。分为旋转式、滑动式、摆动式等。最常用的为旋转式。
2、冷冻切片机：多为恒冷箱切片机用于组织化学、免疫组化及病理诊断。
3、火棉胶切片机：多用于眼球、内耳、脊髓和脑的切片，切片厚度可达20µm～50µ。
二、组织切片刀 P58
（一）切片刀的种类： 其长度一般有 4cm、8cm、14cm、18cm、20cm、24cm等。
1、平凹型：一侧为直线，另一侧为凹度，大凹度刀适用于火棉胶切片，小凹度刀适于石蜡切片。
2、双平型：刀身两侧均无凹度，两面是平面。适用于冷冻切片和轮转式切片机的石蜡切片。
3、双凹型：刀身两侧均有凹度，适用于轮转式石蜡切片。
4、一次性刀片：需配置专用刀架。
（二）刀背套与刀柄：刀背套供磨刀时用，刀背套有金属和塑料两种。刀柄有木制及塑料制两种。
（三）磨刀与被刀：
1、手工磨刀法：
①磨刀前用软布试净磨刀石面尘垢；
②装上刀背和刀柄，滴磨刀油于磨刀石上；
③右手紧握刀柄，左手紧按刀背另一端，刀刃向前，逐渐推动刀片至磨刀的一端，从右到左全部磨完。
2、被刀：用被刀皮革被刀，与磨刀的动作相反；
三、石蜡切片制作 P60
（一）切片前的准备：
修整蜡块，然后置于冷水或冰箱中冷却，以增加硬度；
准备毛笔、眼科弯镊子；
载玻片均匀涂上薄层蛋清甘油，占2/3；
接通摊片机电源，调节摊片（42℃～48℃）
烤片（60-70℃左右）的温度；
（二）快速石蜡切片 P63 快速石蜡切片时，组织取材应薄，厚度一般不超过2mm，组织固定后要重新修正至1.5mm左右厚度，以利脱水，将组织块埋入预制的蜡块内，冷却硬化后方可切片（取材、脱水、透明浸蜡、包埋见）。
切片捞至载波片上，用酒精灯略加烘烤，再入二甲苯脱蜡，经95%酒精后即刻入水水化，随后即可进行常规快速苏木素伊红染色。
（三）冷冻切片制作 P64 组织经过冷冻后，其内的水分结冰，使组织变硬，有利于切成薄片。
一、设备要求：
（一）冷冻切片机：一般由转轮式切片机或推拉式切片机加上制冷装置而成：
1、二氧化碳制冷器；
2、半导体制冷器；
（二）恒冷箱冷冻却片机：利用压缩机通过制冷剂循环制冷。
冰冻切片机
二、制作过程
（一）取材、固定：选取有代表性的组织制片，厚度1～2mm。一般病理急诊、组织化学显示酶和免疫病理学进行荧光抗体研究等，多数都用新鲜组织直接冷冻，切片后再进行固定、染色或直接染色或孵化。采用二氧化碳冷冻设备制作须先固定。
（二）冷冻切片方法：
1、恒温箱冷冻切片法
（1）开机预冷：切片前2～3小时，所需温度如下： 各种新鲜组织冷冻切片参考温度（℃）脑、淋巴结、肝、肾、脾、睾丸-12--16 肌肉、肾上腺、甲状腺、子宫、卵巢-18--22 乳腺、皮肤、前列腺-22--28（2）放入、速冻、修整组织，待恒冷箱内温度降至要求温度后，将组织用OT包埋，再速冻1～2分钟，装于机样本夹上，修平；（3）调节抗卷板，以与刀刃平行对齐；
（4）切片：所需厚度为4µm～8µm，用毛笔展平，贴于洁净玻片上，晾干或吹干后染色；（5）切片后处理：清洁保养。
2、半导体冷冻切片法
3、二氧化碳冷冻切片法
（三）冷冻切片粘片法
1、蛋白甘油粘片法：
按石蜡切片的粘片法处理，但温度不宜超过40℃。烤干后即取出，70%酒精和自来水洗后即可染色。
2、Lillie明胶粘片法：切片放入1%明胶水溶液数分钟，捞到载玻片上，5%甲醛水溶液固定5分钟，水洗10分钟，即可染色。
3、酒精明胶粘片法：切片浸入0.1%或0.75%明胶溶液（用40%酒精配制）数分钟，用载玻片捞起后，室温干燥，入氯仿1分钟，经95%和75%酒精洗去氯仿，再经蒸馏水洗后即可染色。
三、注意事项
1、冷冻切片的组织不用固定；
2、组织尽可能新鲜，不能用湿的盐水纱布包裹和放入10℃冰箱内缓慢冷却，否则组织内水分可逐渐析出形成水晶，造成组织结构破坏；
3、冷冻包埋剂应适量；
4、组织太小，不能做冷冻切片；
5、冷冻时间太久的组织不能马上切片，以免损伤切片刀；
6、一般来说骨组织和钙化组织不能做冷冻切片。观察
第七章组织切片染色技术
第一节 病理切片染色概述 P68
一、概念：用染液对组织切片进行处理，使组织中的不同成分被染上相应的颜色，产生不同的折射率，以利于显微镜观察和分析。
三、染色的原理
染色就是染色剂和组织细胞相结合的过程。
（一）染色的化学反应：组织细胞的酸性物质与碱性染料的阳离子相结合，碱性物质与酸性染料的阴离子相结合。具有酸性的细胞核被碱性苏木素液所染色，碱性的胞质与酸性染料伊红所染色。
（二）染色的物理作用：
1、渗透作用：染料进入组织；
2、吸附作用：把另一种物质的分子、原子、离子集中在界面上的过程；
3、吸收作用（溶解作用）。
三、常用染料概述：
（一）染料的性质：有色的无机物或有机化合物
1、发色团：能使染料分子产生颜色的基团，叫发色团；
2、助色团：能使染料分子颜色加深，并与被染物质分子形成亲和力的基团。
（二）染料的分类：
1、据染料来源：天然、合成染料和无机化合物
2、根据染料化学反应：酸性、碱性和中性染料
3、据染色对象：（1）组织染料： 1）结缔组织和肌纤维染料：有胶原纤维、网状纤维、弹力纤维和肌原纤维等染料； 2）神经组织的染料：尼氏体、神经轴突、神经髓鞘、神经胶质细胞等染料；（2）细胞染料：细胞核、细胞质染料等
常用染色剂简介见附录一。
五、常用染色术语的概念
一、普通染色：最常应用的是苏木素-伊红染色法，简称HE染色。
二、特殊染色：特染是为了显示特定的组织结构或其他的特殊成分。
三、单一染色：选用一种染料染色。
四、复染色：用两种不同性质的染料染色方法。
五、多种染色法：用两种以上染料的染色法。
第三节 染色前后的处理 P74
一、染色前的处理：
1、脱蜡至水：必须经过二甲苯脱蜡、各级酒精（100%、95%、85%、75%）至水洗的过程。
2、脱汞盐结晶：切片在脱蜡后用0.2%～0.5%碘酒精处理5～15分钟，使汞盐沉淀物溶解。
3、脱甲醛色素：在切片脱蜡至水后，用Verocay液（1%氢氧化钾水溶液1ml，80%酒精100ml）处理10分钟，然后流水冲洗5分钟再常规染色。
（二）染色后的处理：
1、分化作用：必须用1%盐酸酒精脱去所吸附的染料。
2、蓝化作用：分化后，用碱性水使细胞核变成蓝色。
3、染色后的脱水：低度到高度酒精逐步脱水。
4、染色后的透明：透明剂用二甲苯。
三、封固：
1、封固剂：
（1）甘油明胶封固剂
配制方法：明胶10g，蒸馏水60ml，甘油70ml，石炭酸0.25g。（用前将甘油明胶置于温箱内融化后即可封片）。（2）中性树胶（二甲苯树胶液）：属油性封固剂，组织切片需彻底脱水、透明。优良封固剂，可直接封片。
七、染色的注意事项
（1）具备实验室基本设备和染色准备工作（2）正确完成固定、脱水、透明、脱蜡步骤；
（3）染色过程中，既要按书本的方法进行操作，又要根据实际情况进行灵活运用。
第八章 组织切片常规染色技术 第一节 常规染色的概念
一、染色原理
（一）苏木素染色原理：苏木红和铝结合形成带正电的 蓝色色精，带负电的细胞核与带正电的蓝色色精以离子键或氢键结合而被染色。苏木素在碱性溶液中呈蓝色，所以细胞核被染成蓝色。
（二）伊红染色原理：伊红Y是一种化学合成的酸性染料。在伊红Y染料液中加入醋酸，使胞质中蛋白质带正电荷，可被带负电的伊红染料染色，从而使细胞质及红细胞等染成红色或粉红色，与蓝色的细胞核形成鲜明的对比。
二、染液的配制 P80
（一）苏木素液：从苏木素的树中提炼的天然染料。
1、Harris苏木素液：最常用。
苏木素 1g 蒸馏水 200ml 无水酒精 10ml 氧化汞 0.5g 硫酸铝钾 20g 配置方法见书81页。染色3～4分钟。保存时间为一年。
（二）伊红染液：
0.5%伊红酒精染液:醇溶伊红Y0.5g，95%酒精100ml。染色时间1～3分钟。水溶性伊红酒精液： 沉淀酸化伊红Y酒精液：
2、Mayer苏木素改良配法：
（1）A液：苏木素2g，无水酒精40ml加热溶解；
（2）B液：硫酸铝钾100g，蒸馏水600ml，稍加热使硫酸铝钾在水中溶解，再将A与B液混合2分钟。用蒸馏水补足600ml，加入400mg碘酸钠充分混匀，苏木素染液呈紫红色即可。染色时间为10～20分钟。
3、Ehrlich苏木素液：苏木素2g，无水酒精100ml，甘油100ml，硫酸铝钾15g，蒸馏水100ml，冰醋酸10ml。（染色时间为10～20分钟）。
4、Gill改良苏木素液：苏木素2g，无水酒精250ml，硫酸铝钾17.6g，蒸馏水750ml，碘酸钠0.2g,冰醋酸20ml。染色时间为5分钟。
（三）0.5%～1%盐酸酒精分化液：
盐酸 0.5ml～1ml, 75%酒精99ml。此液用一段时间后需要延长时间或更换液体，新液体分化时间要短。
（四）蓝化液：“蓝化”是指苏木素液染细胞核后，通过盐酸酒精分化，切片由酸性转入弱碱性液体，使之变蓝的过程。
1、50℃温水
2、稀氨水（1%氢氧化铵液）3 蒸馏水 100ml，氨水1ml。
三、染色方法 P83
（一）人工操作苏木素-伊红染色方法：
1、脱蜡至水：
（1）二甲苯Ⅰ脱蜡（脱蜡2-5分钟）；（2）二甲苯Ⅱ（2-5分钟）；（3）无水酒精Ⅰ（1-2分钟）；（4）95%酒精1分钟；（5）85%酒精1分钟；（6）75%酒精1分钟；（7）自来水洗2分钟；
2、苏木素染色：苏木素液染色5-10分钟；自来水洗1分钟；
3、分化返蓝：0.5%～1%盐酸酒精分化数秒至30分钟呈紫红色；自来水1分钟；用温水(50℃)蓝化5～15分钟(或稀氨水蓝化30秒，自来水洗5～10分钟)；
4、伊红染色：水溶性伊红可直接入伊红液，1分钟；自来水洗1分钟；
5、脱水、透明：
（1）85%酒精（20秒）；（2）95%酒精Ⅰ（1分钟）；（3）无水酒精Ⅰ（1分钟）；（4）二甲苯Ⅰ（1～2分钟）；（5）二甲苯Ⅱ（1～2分钟）。
6、封固：
（1）用中性树胶封片；
（2）附贴标签可书写病理编号。
（二）冷冻切片HE染色：
冷冻切片贴片后，用95%酒精和冰醋酸5ml的混合液固定1分钟，自来水洗30秒～1分钟，HE染色。
（三）快速石蜡切片染色：脱蜡至水、HE染色
第三节 染色中常见问题及注意事项 P85 HE染色结果：
细胞核被苏木素染成明显的蓝色；
细胞质被伊红染成红色。
第九章 组织切片特殊染色 P87 为了显示特定的组织结构或组织细胞特殊成分，采用特定的染料和方法对组织切片进行染色。第一节 结缔组织染色 P88
一、胶原纤维染色
Van Gieson染色法（简称VG染色）（书上无）
1、染料配制：
（1）铁苏木素液：见Maon三色染色（2）Van Gieson苦味酸酸性品液：
甲液：1.22%苦味酸饱和水溶液90ml，乙液 ： 1%酸性品红水溶液10ml。
两液提前配制，临用前混合使用。
2、染色步骤：
（1）切片脱蜡至水（2）蒸馏水洗（3）Weigert铁苏木素液染5～10分钟（4）自来水洗2分钟
（5）据情况可用0.5%盐酸酒精分化（6）自来水洗至变蓝再用蒸馏水洗（7）Van Gieson液染色3～5分钟（8）去染液，用95%酒精分化脱水
（9）无水酒精脱水（10）二甲苯透明（11）中性树胶封固。
3、染色结果：胶原纤维红色,肌纤维黄色, 细胞核黑色.4、胶原纤维染色的应用 P88（1）对梭形细胞肿瘤来源、性质提供诊断和鉴别诊断的依据；
（2）显示各种组织、器官病变时的修复情况与纤维化程度，如肝穿组织中纤维组织的含量与分布的观察；
（3）鉴定心肌坏死后疤痕的形成；
（4）鉴别心内膜弹力纤维增生症与心内膜心肌纤维化。
三、网状纤维染色 Gomori银染法: P921、染液配制：银氨溶液：甲液：硝酸银10.2g,蒸馏水100ml；乙液:氢氧化纳3.1g,蒸馏水100ml2、染色步骤：（1）切片脱蜡至水（2）高锰酸钾氧化液（高锰酸钾0.5g,蒸馏水95ml,再加3%硫酸5ml)5分钟(3)水洗1分钟(4)2%草酸漂白2分钟,水洗2分钟(5)2%硫酸铁铵媒染2分钟(6)蒸馏水充分洗(7)氨银溶液染色1分钟(8)蒸馏水洗3次(9)20%福尔马林液还原5分钟(10)蒸馏水洗2次(11)入0.2%氯化金液中调色2分钟,蒸馏水洗2次(12)2%硫代硫酸钠固定2分钟,自来水、蒸馏水洗（13）必要时用VG或伊红复染（14）无水酒精脱水（15）二甲苯透明（16）中性树脂封固。
3、染色结果：网状纤维呈黑色，胶原纤维呈红色。
4、网状纤维染色的应用
（1）区分上皮性与非上皮性肿瘤；（2）区分血管内皮瘤与血管外皮瘤；（3）判断原位癌与早期浸润癌；
（4）观察肝脏病变处的网状支架塌陷或增生的情况，判断病变性质、程度及发展与转归。
四、多色染色： P93
（一）Maon三色染色法： P931、染液配制：
（1）丽春红酸性品红液：丽春红0.7g，酸性品红0.3g，冰醋酸1ml，蒸馏水99ml（先配好醋酸溶液后，分别溶解丽春红或酸性品红）；亮绿液：亮绿1.0g，冰醋酸1ml，蒸馏水99ml。（2）苯胺蓝液：苯胺蓝2g，冰醋酸2ml，蒸馏水加至100ml。
（3）Weigert铁苏木素液：甲液：苏木素1g，95%酒精或无水酒精100ml；乙液：29%三氯化铁水溶液4ml，纯盐酸1ml，蒸馏水95ml（临用前取甲、乙两液混合即可，24小时内使用有效。）
2、Maon三色的染色步骤：（1）切片脱蜡至蒸馏水；
（2）Weigert铁苏木素染色5～10分钟；（3）流水稍洗；（4）盐酸酒精分化；（5）流水冲洗数分钟；
（6）丽春红酸性品红液染色5分钟；（7）蒸馏水稍冲洗；
（8）1%磷钼酸水溶液处理5分钟，镜下见肌肉纤维呈红色，胶原纤维呈淡红色即可；（9）不经水而直接用苯胺蓝液或亮绿液染5分钟；（10）1%冰醋酸处理1分钟；（11）95%酒精、无水酒精脱水；（12）二甲苯透明；（13）中性树胶封固。
3、染色结果：胶原纤维呈蓝色（用苯胺蓝染）或绿色（用亮绿染），肌纤维、细胞质呈红色，细胞核呈蓝褐色。
（二）Mallory三色染色法 P941、染液配制：
（1）0.5%酸性品红水溶液；
（2）苯胺蓝橙黄G液：苯胺蓝0.5g，橙黄G 2g，磷钨酸1g，蒸馏水100ml。（先将1%的磷钨酸溶液配好，一半用于溶解苯胺蓝，另一半用于溶解橙黄G，加热溶解，冷却后分别过滤，可长期保存。临用前将两液混合）。（3）重铬酸钾液；
2、染色步骤：
（1）切片脱蜡至水；（2）Zenker固定液固定1小时；（3）充分水洗；（4）0.5%碘酒精处理5～10分钟；（5）0.5%硫代硫酸纳处理2～5分钟；（6）充分水洗，再用蒸馏水浸洗；（7）酸性品红液染5分钟；（8）水洗、蒸馏水洗；（9）苯胺蓝橙黄-G液染20～30分钟；（10）直接95%酒精快速分化；（11）无水酒精脱水；（12）二甲苯透明；（13）中性树胶封固。
3、染色结果：胶原纤维、网状纤维呈蓝色，心机纤 维橘红色，红细胞呈浅黄色，细胞核呈黑色。
结缔组织复合染色的应用（1）区分各种纤维成分；
（2）判定各种组织、器官的病变程度和修复情况；（3）鉴别某些梭形细胞软组织肿瘤的来源的判断（4）用于肾小球肾炎的诊断。
第二节 肌肉组织染色 P95
（一）Mallory磷钨酸苏木素染色法（简称PTAH）：
1、染液配制
（1）磷钨酸苏木素：苏木素0.1g, 磷钨酸2g, 蒸馏水100ml。
将苏木素加入20ml蒸馏水中,加热溶解，再将磷钨酸溶于80ml蒸馏水中。苏木素冷却后将两液混合放置3～3月后使用。此液可保存数年。急用时可加高锰酸钾0.15g促成熟,12～24小时即可用。
（2）酸性高锰酸钾液：5%高锰酸钾水溶液50ml；
0.5 硫酸水溶液50ml。
2、染色步骤：
（1）组织以Zenker液固定最佳；如用甲醛固定则先要用Zenker液处理（37℃温箱内）3小时；
（2）切片脱蜡至水，用碘液除汞，用95%酒精脱碘；（3）充分水洗；（4）酸性高锰酸钾液处理5～10分钟（5）自来水洗2分钟；（6）1%草酸漂白1分钟；（7）自来水洗，蒸馏水洗2次；
（8）磷钨酸苏木素液浸染24～48小时；（9）直接用95%酒精分化；（10）无水酒精脱水；（11）二甲苯透明；（12）中性树胶封固。
3、染色结果：横纹肌纤维、细胞核呈紫蓝色，胶原纤维、网状纤维呈玫瑰红色。
4、肌肉组织染色
常用于Mallory磷钨酸-苏木素染色法能显示与区分：(1)横纹肌纤维的正常与异常形态；
(2)诊断心肌损伤早期病变及全身弥漫性血管内凝血有一定参考价值；(3)用于横纹肌肉瘤时显示横纹，(4)用于显示神经胶质。
第三节 脂肪染色 P96 苏丹Ⅲ染色法：(书上无)
1、染料配制：
（1）苏丹Ⅲ染液：苏丹Ⅲ 0.15g,60%～70%酒精100ml。（将苏丹Ⅲ染料溶于60%～70%酒精形成饱和液，作长期备用液。临时配制时需要过滤才可使用。备用液仅用上清液。密封容器存放备用液）。
（2）甘油明胶液：明胶 5g，甘油35ml，蒸馏水 35ml。（先将明胶溶于蒸馏水中加热溶解，再加甘油充分混合，加1～2粒石炭酸。冷却后4℃保存，用时水浴加热）。
2、苏丹Ⅲ染色步骤：
（1）冷冻切片厚8µm～10µm；（2）蒸馏水稍洗；（3）Harris苏木素1～2分钟；（4）自来水洗，盐酸酒精分化、反蓝；（5）水洗、蒸馏水洗；（6）70%酒精浸洗；
（7）苏丹Ⅲ染液30～60分钟（如置于56℃温箱中可缩短时间）；（8）70%酒精分化数秒；（9）蒸馏水洗；（10）在空气中稍晾干；（11）甘油明胶液封固。
3、注意事项：采用冰冻切片染色。苏丹Ⅲ染液温浸时应加盖，防止染液中的酒精或丙酮挥发。在封固前，甘油明胶液应放置56℃温箱中加温，避免摇荡，防止封固时出现气泡。切片染色后不能长期保存，应尽快观察或照相。
4、染色结果：脂肪呈橘红色，脂肪酸不作色，细胞核呈淡蓝色。
5、脂肪染色的应用（1）鉴别细胞内空泡的性质（水样变性、脂肪变性或糖原）；
（2）显示动脉粥样斑块病灶内的脂质沉积、脂肪栓塞。
（3）神经系统一些变性、脱髓鞘疾病的诊断有极为重要的作用。
（4）脂肪染色主要用于卵巢纤维瘤与卵泡膜细胞瘤、肾母细胞瘤、皮脂腺癌的诊断和鉴别诊断。
第四节 糖原染色与粘液染色
一、过碘酸雪夫染色法（PAS法）：P981、染色配制：
（1）过碘酸氧化液：过碘酸0.5g，蒸馏水100g。（此溶液应放4℃冰箱保存）。（2）Schiff液：碱性品红 1g，1mol/L盐酸 20ml，偏重亚硫酸钠（钾）1g，双蒸馏水200ml。（先将双蒸馏水200ml煮沸，加入1g碱性品红，再煮沸2分钟。冷却至50℃加1mol/L的盐酸20ml，待温度降低至25℃时，加入偏重亚硫酸钠（钾）1g～1.5g,温室2小时后碱稍带红色，5小时后为无色液体，如有颜色应加入活性炭1g～1.5g,用双层滤纸过滤,盛于棕色磨口瓶内,放入4℃冰箱保存。
2、染色步骤：
（1）切片脱蜡至水；（2）蒸馏水洗；（3）0.5%过碘酸氧化液10～20分钟；(4)充分蒸馏水洗；（5）进入Schiff液染色10分钟（如室温低于15℃可稍加温）；（6）自来水洗10分钟；（7）用Mayer或 Harris明矾苏木素染细胞核3～5分钟；（8）盐酸酒精分化；（9）水洗；（10）无水酒精脱水；（11）二甲苯透明；（12）中性树胶封固。
3、染色结果：糖原及其它PAS反应阳性物质 染成红色，细胞核染成蓝色。
4、糖原染色的应用
（1）用于显示糖原，对明确细胞空泡的性质、糖原贮积病和糖尿病的诊断及某些透明细胞肿瘤的鉴别诊断方面具有重要作用。
（2）用于中性黏液物质，对低分化腺癌的诊断也有一定价值。
（3）清楚地显示基底膜（肾炎的诊断）、网状纤维、真菌菌丝、寄生虫及腺泡状软组织肉瘤中胞质内结晶体。
（4）观察缺血缺氧早期心肌坏死或梗死区的糖原减少情况。
粘液染色
二、奥辛蓝染色法（简称AB染色）：P991、染液配制：（1）AB液：（pH 2.5)奥辛蓝8GS 1g，蒸馏水97ml，冰醋酸3ml，麝香草酚2粒（防腐）。（先配好3%冰醋酸，然后溶解奥辛蓝。过滤后使用。pH值2.5～3.0之间.(2)0.5%中性红水溶液: 中性红 0.5g,蒸馏水加至 100ml。
2、奥辛蓝染色步骤：
(1）石蜡切片脱蜡至水；(2)AB液染色20～30分钟；（3）快速蒸馏水洗；（4）0.5%中性红染1～2分钟；（5）快速只能流水洗；
（6）95%酒精、无水酒精脱水；（7）二甲苯透明；（8）中性树胶封固。
3、染色结果：酸性粘液物质（及真菌菌丝、隐 球菌的夹膜）呈蓝色，中性粘液呈红色，混合 粘液呈紫红色，细胞核呈红色。
4、粘液染色的应用
（1）黏液性肿瘤的诊断和鉴别诊断，如黏液瘤、黏液肉瘤、脂肪瘤、胃肠道低分化腺癌、软骨黏液样纤维瘤；
（2）用于结缔组织疾病及慢性胃炎肠上皮化生等的诊断。
第五节 病原微生物染色 P100 石炭酸品红抗酸杆菌染色法：P1011、染色配制：
石炭酸品红液：碱性品红 1g，无水酒精 10ml，石炭酸（5%）水溶液100ml。
（首先将碱性品红溶于无水酒精，然后与石炭酸水溶液混合，临使用前过滤）。
2、抗酸杆菌染色步骤：（1）石蜡切片脱蜡至水；
（2）将石炭酸品红液滴切片上，文火热至蒸气出现，离火染15～20分钟；（3）蒸馏水洗；
（4）1%盐酸酒精液分化，至无红色染料流下止；（5）蒸馏水洗；（6）1%美蓝液复染2分钟；（7）95%酒精分化，美蓝脱色，以示清楚；（8）无水酒精脱水；（9）二甲苯透明；（10）中性树胶封固。
3、染色结果：抗酸杆菌(如结核杆菌、麻风杆菌 等）呈红色，细胞核呈淡蓝色。
4、病原微生物染色的应用
用于结核病的干酪样坏死灶及麻风病中泡沫状细胞（瘤型麻风）内的抗酸杆菌，其形态特点是：结核分支杆菌弯曲细长，长短粗细不一；而麻风杆菌短粗成堆，数量较多（称为麻风团）。
淀粉样物质的染色（书上无）Bennhola刚果红染色法：
1、染色配制：
（1）1%刚果红水溶液： 刚果红 1g，蒸馏水100ml。（2）碳酸锂饱和水溶液：碳酸锂 1.25g，蒸馏水100ml。
2、染色结果：
淀粉样物质呈红色，其它组织呈浅红色，细胞核呈蓝色。
3、Bennhola刚果红染色步骤：（1）石蜡切片脱蜡至水；（2）明矾苏木素染液淡染细胞核3～5分钟；（3）1%盐酸酒精液稍分化。水洗1～2分钟；（4）充分水洗返蓝；（5）蒸馏水稍洗；
（6）1%刚果红溶液染色10～30分钟或更长；（7）经碳酸锂饱和溶液处理1～2分钟；
（8）80%酒精液急速分化至无红色染液流下为止；（9）水洗1～2分钟；
（10）95%酒精脱水及无水酒精脱水；（11）二甲苯透明；（12）中性树胶封固。
4、淀粉样物质的染色的应用
（1）淀粉样物质染色能显示变性程度:如全身淀粉样变性；（2）用于全身消耗性疾病的观察:如结核病、甲状腺髓样癌等；（3）用于肿瘤的诊断和鉴别诊断:如内分泌肿瘤的间质常出现淀粉样物质沉着，又如甲状腺髓样癌、胰岛细胞瘤、肺小细胞癌等，淀粉样物质染色阳性可作为诊断重要依据；
（4）为某些疾病的诊断与鉴别诊断提供依据:钙化上皮瘤、声带息肉等常出现淀粉样变性，可为诊断依据。
黑色素染色
Maon-Fontana染色法：
1、染液配制：
（1）Maon-Fontana染：10%硝酸银 15ml，蒸馏水 15ml。（将浓氨水逐滴加入10%硝酸银液中直至微乳白色，并加入蒸馏水15ml，过滤后静置1～2小时后使用。4℃冰箱保存，恢复室温后使用，每次使用前应重新过滤）。（2）5%硫代硫酸钠水溶液。
2、染色结果：黑色素、嗜银细胞颗粒呈黑色，细胞核、胶原纤维呈红色。
3、黑色素（Maon-Fontana）染色步骤：（1）10%福尔马林固定组织，石蜡包埋；（2）切片脱蜡至水；（3）蒸馏水充分洗；
（4）用Maon-Fontana液室温染18～48小时；（5）蒸馏水细数次；
（6）用5%硫代硫酸钠水溶液固定5～10分钟；（7）蒸馏水洗数次；
（8）用0.5%中性红对比染色1～2分钟；（9）蒸馏水洗5～10分钟；（10）无水酒精脱水；（11）二甲苯透明；（12）中性树胶封固。
4、黑色素染色的应用 主要用于黑色素瘤的诊断，尤其是无色素性的分化差的黑色素瘤的诊断极为重要；对淋巴结内转移的肿瘤细胞，证实有无黑色素的存在对肿瘤的诊断可提供有利的证据；还有一些肿瘤及疾病中也存在色素，如色素性神经瘤、透明细胞肉瘤、黑色棘皮病、老年疣等等均可提供诊断依据。
第十五章 病理检验技术进展 P177
一、计算机图像分析技术
二、流式细胞仪技术
三、分子病理学技术
第十六章 病理档案管理 P190
二、组织制片常用玻璃器具：（1）染色缸：
（2）标本瓶：用于脱水、透明及染色；（3）培养皿：盛装蛋清甘油；
（4）配制试剂用具：量筒、量杯、烧杯、三角烧瓶、漏斗、吸管、滴管、滴瓶、试剂瓶、蒸馏水瓶、玻璃棒及研钵等；（5）酒精灯：用于染液配制等；（6）载玻片：（7）盖玻片：
3、免疫组化常用设备：（1）微波炉或高压锅；（2）微量加样器；（3）微波震荡器；
（4）恒温水浴箱或湿盒；
4、常用器械盒工具：
（1）标本巨检器械：解剖刀、手术刀、手术剪、镊子、血管钳、不绣钢尺、搪瓷盘等；（2）尸体剖验器械；
三、常用玻璃器材的清洗方法
（一）新购玻璃器皿的处理: 先用洗衣粉浸泡洗刷,自来水洗后再用1%～2%盐酸水溶液浸泡数小时后，用自来水冲洗干净，再用蒸馏水洗2次。
（二）使用后玻璃器皿的清洗方法：
（1）自来水冲洗；
（2）毛刷蘸洗衣粉洗擦干净；
（3）自来水冲洗；
（4）凉干后放入清洁液内浸泡24小时；
（5）自来水冲洗干净，最后用蒸馏水洗2次；
（6）把器皿置于有孔架上凉干或温箱中烤干，备用。
清洁液的配制：重铬酸钾+浓硫酸+蒸馏水
（三）新购载玻片的处理：
高质量的已经处理，可直接使用。对不净的可放入清洁液浸泡5～12小时以上，流水冲洗，蒸馏水清洗，95%酒精浸泡，擦干备用
（四）新购盖玻片的清洗：
投入清洁液中浸泡1～2小时左右，经流水反复冲洗，蒸馏水洗，后投入95%酒精浸泡数分钟，再转入纯酒精中浸泡，使用前用洁净绸布擦干或在温箱中烤干备用。
（五）旧载玻片的清洗：
用洗衣粉液煮沸30分钟。
（六）旧盖玻片的清洗：
先置入1%洗衣粉液中煮沸1分钟，离火，待沸腾水泡平下后，再行煮沸，反复2～3次即可。基层医院病理科（室）应完成：
1、常规石蜡切片：按常规，在3~5天发出报告；
2、冷冻切片或快速石蜡切片：术中快速病理诊断。
3、常用特殊染色和免疫组织化学检查：据临床病理诊断的需要。
4、诊断细胞学检查：完成临床脱落细胞学及穿刺组织涂片检查。
5、尸体剖验检查：与临床医师密切结合，开展新生儿及成人尸检，提高诊断治疗水平。
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