水塔老陈醋大曲中酵母菌的分离鉴定 0909_大曲霉菌的分离鉴定

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水塔老陈醋大曲中酵母菌的分离鉴定

摘要 目的：大曲是山西著名品牌水塔老陈醋发酵的主要原料，其富含多种微生物，研究大曲中酵母菌的组成对老陈醋的发酵生产有重要的指导意义。方法：采用传统分离培养方法，即通过富集培养再稀释涂布、分离纯化出21株酵母菌，对其进行形态学观察、镜检，并且扩增和测定了它们的5.8S-ITS、18S、26S D1/D2区序列，从分子水平上对这些菌株进行了分类学鉴定。结果：测序结果与GenBank 中已知序列进行比对，鉴定到2株弗比恩酵母，8株扣囊复膜酵母，6株异常威克汉姆酵母，3株葡萄牙棒孢酵母，2株东方伊萨酵母。结论：大曲中含有多种酵母菌，分离培养和分子生物学鉴定了酵母菌的种类，为纯种制曲打下了基础。

关键词：大曲，酵母菌，分离，鉴定

大曲是我国传统酿造酒和酿造食醋生产中主要的原料。大曲是酒和食醋酿造过程中重要的微生物、酶类、香气物质和香气物质前提的主要来源[1-2]。大曲中含有多种微生物，可起到糖化、发酵、增香的作用，直接或间接地影响酒和醋的风味及口感。然而，大曲采用开放式富集培养，受场地、工具和制曲室环境以及水、空气等多种因素影响，大曲质量难以得到稳定，同时富集式培养使大曲富含多种微生物，包括功能性微生物和无效、有害微生物，难以保证大曲的质量稳定[3]。酵母菌是大曲中主要的功能性微生物之一，影响酒和老陈醋的发酵生产及口感。分离鉴定大曲中酵母菌的组成，成了近几年酒和食醋的研究热点[4-9]。分离鉴定水塔老陈醋大曲中酵母菌的组成，对提高著名品牌水塔老陈醋的产量和质量有很重要的意义。

采用富集培养再稀释涂布、分离水塔老陈醋大曲中的酵母菌，之后对其进行形态学观察、镜检，扩增和测定它们的18S、5.8S-ITS、26S D1/D2区序列，从分子水平上对这些菌株进行了分类学鉴定。分子生物学的鉴定方法不仅能够快速的将各种酵母鉴定到属或种, 而且鉴定的结果精确度更高。随着数据库中分子信息量的增加, 近年来应用分子生物学技术鉴定酵母菌种的研究越来越广泛[10-17]。

对酵母菌鉴定最常用的分子系统发育分析方法有18S、5.8S-ITS、26S D1/D2区等。酵母菌核糖体小亚基18S rRNA 存在不同保守程度序列的镶嵌现象(从高度保守到半保守区到高可变区)，使得该分子可以用来衡量较远的亲缘关系，也适宜于较近的亲缘关系。这个区域大约有1800bp，含有不同变异率的区段，可以用于种、属或更高等级分类群之间的系统关系研究[10-12]。酵母菌ITS区为核糖体内转录间隔区，位于18S rDNA 和26S rDNA 之间，包括ITS1 和ITS2 两个片断，中间包含一个5.8S rDNA 片段。ITS 区域与rDNA 转录区相比具有较高的变异率，对于亲缘关系较近的菌株间的区分是比较有效的。研究表明ITS 区域的差异大于1% 时就可能代表不同的种，然而对于不同的属而言，情况会有所不同[11-18]。26S rDNA 的 Dl/D2 区域位于大亚基的5'端，序列长度在600bp 左右，该段区域具有较高的变异率，可以用于亲缘关系较近的菌株之间的分类研究，目前已经成为酵母鉴定和系统发育分析的重要“标尺”。虽然酵母种内26S D1/D2 区碱基差异小于1%的标准已被普遍接受，然而此数值仍是一个试验的经验值[11-13,19-20]。

本研究采用传统分离培养和分子生物学相结合，分离鉴定著名品牌山西水塔老陈醋大曲中酵母菌的种类，研究与老陈醋发酵产香等相关菌种，同时也为食醋传统工艺的研究、改造、纯种制曲等提供指导。

1材料与方法

1.1材料与仪器设备

1.1.1 样品和主要试剂

大曲由山西水塔醋液股份有限公司提供。YPD培养基购自北京博奥星。Dream Taq Green PCR Master Mix购自Fermentas;Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR购自宝生物工程有限公司；其它试剂购自北京化工厂。

1.1.2 仪器设备

灭菌锅，无菌工作台，生化培养箱，摇床，分光光度计，荧光显微镜（重庆奥特光学），GeneAmp PCR System 2720(ABI)，ChampGel凝胶成像分析系统（北京赛智）。1.2 方法

1.2.1

培养基和样品制备

1.2.1.1 富集培养基

酵母粉1%，葡萄糖2%，蛋白陈2%，调pH至4.5培养基灭菌后再加入链霉素（终浓度30 ug/ml）、青霉素（终浓度为50 ug/ml），孟加拉红0.033 mg/mL，以抑制细菌和霉菌生长。

1.2.1.2分离培养基

YPD培养基：酵母膏1%，蛋白胨2%，葡萄糖2%，琼脂粉2%。葡萄糖单独115℃灭菌15 min，然后加入培养基中，倒平板。1.2.1.3样品的处理

将曲块经过碾压研磨后混匀过40目筛，保藏在4℃冰箱中备用。

1.2.2

酵母菌的分离

将10 g曲粉加入100 mL无菌水中，在28℃ 200 r/min下摇20 min。取菌悬液3 mL接种于富集培养基中，培养48 h后吸取5 mL稀释涂布法分离，28℃培养2 d，观察菌落形态，配合镜检菌种细胞形态，2～3 次纯化后保存于4℃冰箱中。

1.2.3 菌种菌落形态和细胞形态鉴定

将酵母菌接种于YPD培养基中，培养3d后，观察菌落形态特征和细胞形态。1.2.4酵母菌菌株基因组DNA的制备

取菌种，按方法Lysis Buffer for Microorganism to Direct PCR说明书制备基因组DNA。提取后的基因组DNA作为扩增5.8S-ITS、18S、26S D1/D2区序列的模板。

1.2.55.8S-ITS、18S、26S的D1/D2 区序列扩增

利用通用引物ITS1（引物序列：5'-ACGGGGGGTCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）和ITS4（引物序列：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）以菌株总DNA为模版进行5.8S-ITS序列扩增。利用通用引物EF3（引物序列：5'-TCCTCTAAATGACCAAGTTTG-3'）和EF4（引物序列：5'-GGAAGGGRTGTATTTATTAG-3'）以菌株总DNA为模版进行18S序列扩增。利用通用引物NL-1（引物序列：5'-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3'）和NL-4（引物序列： 5'-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-3'）以菌株总DNA为模版进行26S的D1/D2 区扩增。在50 µl PCR反应体系中加入16 µl水、正向引物和反向引物各2 µl、5 µl 模版、25 µl Taq DNA聚合酶Mix。扩增程序：95℃变性5 min后，95℃变性1 min、55℃退火1 min、72℃延伸2 min、共35个循环，72℃延伸10 min。电泳检测目的条带，扩增产物送北京理化分析测试中心进行测序。1.2.6 数据处理 将rDNA测序结果输入数据库http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/，使用BLAST程序与数据库中的序列进行比对分析。根据比对结果，找出与数据库同源性最高的已知菌种，推测待定菌株可能的属或种。

结果与分析

2.1酵母菌株分离结果和菌种菌落形态、细胞形态鉴定

从水塔老陈醋大曲中分离到优势酵母菌共21株。根据菌落形态特征和菌株细胞形态，将菌株进行初步分类，选取具有代表性的10株菌株，分别编号为M10、Q28、M12、Q13、M17、Q10、M25、Q34、Q7、Q12。其菌落形态与细胞形态见图1。

图1酵母菌细胞形态显微照片（1000×）和菌落形态

Fig.1 morphology under light microscope(1000×)and Colony morphology of yeast

2.2 分子鉴定结果

表1 5.8S-ITS测序比对分析

Table 1 5.8S-ITS sequence analysis of 21 yeast species 菌株

5.8S-ITS 测序比对分析

相似菌株 相似度

M10、Q28 M11、M17、M26、Q6、Q10、Q14、Q25、Q33 M12、Q3 M15、Q13、Q19、Q27 M25、Q2、Q34 Q7、Q12

Cyberlindnera fabianii strain BZR42 Saccharomycopsis fibuligera strain 3-1Y

100% 100%

Wickerhamomyces anomalus strain SX1 Pichia anomala strain CTSP F5 Clavispora lusitaniae isolate GK11 Iatchenkia orientalis strain zhuan 1.2 Pichia kudriavzevii clone STA197lsu

99% 100% 99% 99% 99%

表2 18s测序比对分析

Table 2.18s sequence analysis of 21 yeast species

菌株

18s 测序比对分析 相似菌株

相似度

M10、Q28 M11、M17、M26、Q6、Q10、Q14、Q25、Q33 M12、M15、Q3、Q13、Q19、Q27 M25、Q2、Q34 Q7、Q12

Cyberlindnera fabianii strain NRRL Y-1871 Saccharomycopsis fibuligera strain NRRL Y-2388

Wickerhamomyces anomalus strain TIBx229 Clavispora lusitaniae strain NRRL Y-11827 Candida ontarioensis strain BC 2A Pichia kudriavzevii isolate EM12 Iatchenkia orientalis

100% 99%

99% 99% 99% 99% 99%

表3 26S D1/D2测序比对分析

Table 3.26S D1/D2 sequence analysis of 21 yeast species

菌株

26S D1/D2 测序比对分析 相似菌株

相似度

M10、Q28 M11、M17、M26、Q6、Q10、Q14、Q25、Q33 M12、M15、Q3、Q13、Q27、Q19 M25、Q2、Q34 Q7、Q12

Cyberlindnera fabianii strain BZR42 Saccharomycopsis fibuligera strain s-5b-2 Wickerhamomyces anomalus strain XJHFS-1 Clavispora lusitaniae strain IMAU5Y028(G-1)Pichia kudriavzevii strain DMic 113897

Kluyveromyces marxianus strain IMAU4Y089(QH27-4)

Iatchenkia orientalis strain IMAU3Y005

99% 100% 100% 99% 99% 99% 99%

根据测序结果，鉴定到2株弗比恩酵母（Cyberlindnera fabianii strain BZR42，M10、Q28），8株扣囊复膜酵母（Saccharomycopsis fibuligera strain s-5b-2，Q6、Q33、Q25、M11、M26、Q10、Q14、M17），6株异常威克汉姆酵母（Wickerhamomyces anomalus strain XJHFS-1，Q3、Q13、Q27、Q19、M15、M12），3株葡萄牙棒孢酵母（Clavispora lusitaniae strain IMAU5Y028，M25、Q2、Q34），2株东方伊萨酵母（Iatchenkia orientalis strain IMAU3Y005，Q7、Q12）。结论和讨论

本研究按照酵母菌的富集分离培养方法分离山西老陈醋大曲中的酵母菌，利用形态学菌落形态和细胞形态初步鉴定为酵母菌。

利用通用引物ITS1和ITS4以菌株总DNA为模版进行5.8S-ITS序列扩增，扩增到了酵母菌5.8S-ITS长度为350-650 bp。利用通用引物EF3和EF4以菌株总DNA为模版进行18S序列扩增，扩增到酵母菌的18S长度为1500 bp左右。利用通用引物NL-1和NL-4以菌株总DNA为模版进行26S的D1/D2 区扩增，扩增到酵母菌的26S D1/D2 区长度为500-600 bp。成功扩增了21株的酵母菌的5.8S-ITS、18S、26S的D1/D2 区序列，并进行了测序，测序结果与数据库http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/进行了比对，鉴定到2株弗比恩酵母，8株扣囊复膜酵母，6株异常威克汉姆酵母，3株葡萄牙棒孢酵母，2株东方伊萨酵母。

本研究发现5.8S-ITS序列、18S、26S D1/D2区在鉴定弗比恩酵母，扣囊复膜酵母，葡萄牙棒孢酵母，鉴定结果与模式菌种相识度高并且结果唯一。在鉴定Q3等菌种时，NCBI数据库中库比对结果与异常威克汉姆酵母、异常毕赤酵母相识度均为99%，不易鉴定最后是哪种菌。异常威克汉姆酵母，异常毕赤酵母，异常汉逊酵母，这三种酵母是同物异名，但最新的酵母分类学表明部分异常毕赤酵母更名为异常威克汉姆酵母[20]。在鉴定Q7等菌种时，与东方伊萨酵母、德里阿兹威毕赤酵母、马克思克鲁维酵母相识度均为99%，不易鉴定最后是哪种菌。东方伊萨酵母和库德里阿兹威毕赤酵母也是同物异名，最新的分类学名称是东方伊萨酵母。本文研究中发现，鉴定Q7菌种26S D1/D2区时，BLAST 比对结果与100个提交的基因序列，相识度在99%-100%，GenBank 数据库中酵母菌生物部分 rDNA 序列多、乱，但完整的基因组序列仅有模式种酿酒酵母和弗比恩酵母。目前公共核酸序列数据库酵母菌其它模式属和模式种还存在数据不完整的问题。因此新增并完善已发现的酵母菌相关序列数据信息，建立一个准确、精简、完整的酵母菌序列参照数据库显得十分必要。

本研究对酵母菌鉴定中最常用的分子系统学方法鉴定结果进行比较得出：它们的鉴定结果相互印证，可以确认鉴定的结果。本研究通过最常用的分子系统发育学方法，即5.8S ITS、18S、26S rDNA D1/D2 区序列分析及GenBank 查询和BLAST 比对，对分离自山西老陈醋酿造用大曲分离到的21株酵母菌进行了分类鉴定，同时比较了它们在鉴定结果上的异同。本研究鉴定到8株扣囊复膜酵母，颜华等研究表明利用扣囊复膜酵母进行生物发酵，直接将淀粉加工成人们所需要的各种产品而无需液化、糖化，可节约能源、降低成本，将具有深远的意义。而且，扣囊复膜酵母较传统的酿酒酵母来说，具有更丰富的次生代谢[20]。分离到的几种酵母菌将进一步进行发酵实验，测定发酵后产生的醇类、酯类及老陈醋特征型指纹图谱物质[1, 7, 9, 10, 22, 23, 24]。

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Super-vinegar Daqu Abstract: Daqu is the main raw material of the fermentation of Shuita Super-vinegar.It is rich in many microorganisms.The research on the composition of yeasts in Daqu has important directive significance for the fermentation of Super-vinegar.The 21 yeast strains are purified by traditional method which includes enrichment,dilution,coating etc.They are researched

by

morphological

observation

and

microscopic

examination.Their 5.8S-ITS,18S,26SD1/D2 domain sequences are amplified and measured to identify these strains in molecular taxonomy.The result of sequencing is intercompared with the known sequences in GenBank.It shows that these strains include 2 Cyberlindnera fabianii strains,8 Saccharomycopsis fibuligera strains,6 Wickerhamomyces anomalus strains,3 Clavispora lusitaniae strains,2 Iatchenkia orientalis strains.There are many yeast strains in Daqu.Their isolation,culture,identification in the molecular biology is the basis for culturing purified strain Daqu.Keyword:Daqu,Yeast,isolation,identification