临床荧光PCR结果分析及常见问题_pcr常见问题及分析
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临床荧光PCR结果分析及常见问题
中国人民解放军三零二医院 王海滨
一、荧光 PCR 技术在临床诊、疗中的应用
PCR 技术是于 1983 年由 Mullis 发明，后来传到我国，但是由于实验污染的问题，1998 年卫生部取缔 PCR 实验方法在临床诊断中的应用。荧光 PCR 出现后，污染减少很多，但近几年由于磁珠的应用，污染又再起。2003 年，PCR 在 SARS 的早期诊断中非常有效，当时使用的是电泳法。H1N1 甲型流感（2009）：荧光 PCR 技术作为确诊指标（755 份 / 天）。疾病易感基因的研究（SNP）： CR1/ 丙型肝炎 IL-28B。疾病（肿瘤）易感基因的鉴定。
二、影响临床荧光 PCR 检测结果的因素
（一）影响临床荧光 PCR 检测结果的常见因素
1.检验因素：
实验室硬件、仪器、试剂、人员素质、技术水平、管理水平。2.非检验因素：
标本采集、质量、部位、标本保存、条件、时间、标本中的干扰物质、样本丢失！
（二）加强检测前标本的质量管理——避免问题重复发生
规范标本前处理流程、制度化的重要性，建立不合格标本记录和定期总结制度、制定解决措施与可行路径（编号和项目错误等），查找标本丢失可能的环节。加强本室新进工作人员流程培训，经常性进行临床医护的交流与培训。
（三）实验室分区
分为：试剂配制、核酸提取、PCR 扩增以及开放产物分析等区域。分区目的：通过物理分割达到标本、试剂或使用器具等被沾染或掺入污染，标本间的交叉污染等。
分区要求：至少要有清洁的试剂配制和核酸制备区
三、试剂配制
（一）试剂配制室的设置与维护
以空间内无核酸气溶胶为准！．正压、清洁进风(壁挂式空调)。
试剂冰箱内勿存放病原或核酸相关物品！定期清洁除霜！2 ．有效氯消毒液清洁实验室台面、地面。3 ．移液器：使用前的清洁。．离心机等：每周定期木浆纸巾擦拭，方法。“一次性物品的使用没有质控就没有质量保证
对一个完整的实验，一定要注意有空白对照，阴性对照与临界对照，临界对照是对精密度的考核。另外，有平行定量标准品。如果试验测的是血清，质控标准品也应该是血清，而不是人造核酸。
质控品在结果报告中的应用非常重要： 1.空白对照
一般放在第一孔的位置，监控扩增试剂及环境污染。2.阴性对照
第二孔位置，监控核酸提取，试剂是否污染，可自行制备。3.临界对照
实验室自行制作，是实验精确度需求。4.等效定量标准品
中间位置或最后，实验准确性前提，参与核酸提取，标准范围宽。
（六）质控品的制作
HBVDNA ：介质的选择、临界质控的制作： 400IU/ML-50IU/ML ； HCVRNA ：介质的选择、临界质控的制作： 3000IU/ML-100IU/ML ； EBVDNA/CMVDNA/H1N1/HPV 等定性试剂盒的质控，阳性标本，稳定性实验；质控品的朔源： WHO 标准或 COBAS 等；自建质控品：建立数据记录（稳定性等）；室间质控与室内质控的有机结合！
（七）HBVDNA 结果分析（质控在控与失控）HBVDNA 结果分析，就是荧光曲线的分析，要尽可能保证报告的数值，低限值和高于低限值的线要平行，尽可能不要失控。
临界质控品： 400IU/ml ；基线的选择：平均荧光值的 3-7% ；斜率：保持在 3.0-3.6(均值 3.3)；相关系数： r=0.999。
1.COBAS 定量内标(QS)的失控
PPT21 显示的是 COBAS 定量内标失控的情况。2.不同定量区域 QS 值分布
PPT22 显示的是不同定量区域 QS 的分布，例数是 900 多例。如果内标出现了失控，定量值就无法参考了。
3.假阴性曲线的识别
在荧光 PCR 曲线里面，如果有荧光曲线是阴性、不规则的，要考虑是不是有干扰物质，在试剂配制或者标本里边有干扰物质。此时需要复检。
五、实验室人员（与职称和学历无关）
（一）实验室人员分类
1.实习型：
按照操作说明进行操作，但环节控制、环节间衔接和防污染意识差！2.工作型：
能够再现说明书操作要求，具有质量环节控制意识，具有一定的防污染常识，但发现问题和解决问题能力稍差。
3.示教型：
明晰试验操作的关键环节，并能够对下级工作人员进行演示和示教，具有完整的防污染意识、质量实现和一定的发现问题解决问题能力。
4.专家型：
能对商品试剂盒存在的问题进行改进，具有提前预知的质量意识。
（二）移液器的使用
移液器的使用，是小问题，大学问。1.移液器加吸头的要点，需慢慢压，不能用力压。2.不同量程移液器的应用要点（液体性质）。3.移液器连续分液挂滴对实验的影响。4.如何避免移液器连续分液导致的污染。5.移液器吹打混匀带来的污染！6.移液器的清洗，需要高压吗？ 7.移液器的校准，很多单位无法实现。
（三）质量环节意识的培养（轮流当主任）
1.环节控制能力
质量环节的认知：明晰实验操作环节的组成和目的！关键环节的实现：细节的严谨性与准确性！环节的连贯性与细节实现：实现完整实验！2.防污染素质
实验室环境防污染意识：具备科学防污染清洁意识和实现能力，如标本外溢的处理、实验室环境（空气、桌面、地面、移液器等）清洁，实验废物的管理和处理，离心机的清洁和维护等。标本间交叉污染的预防意识和实现能力：避免移液过程中的隐形迸溅污染（移液器）；试剂加样过程中的沾染污染；标准品的携带污染等。扩增产物的外露污染：产物回流预防能力；产物处理流程。
（四）人员的培养与专业技能比对
不同职务、职称和学历人员同时进行；环节操作与结果同时计分；比对结果记录在案并作为评聘指标。
六、试剂盒的质量与评价
（一）评价标准：抗干扰-理论值与实际值的吻合。
1.特异性：不同血清型对特异性的影响，抗污染性能和污染试剂 2.敏感性：血清量、加样量对敏感性的影响（1+1=2 ？）, 试剂系统的组成与敏感性 : 引物、探针序列的选择与用量，跨栏式试剂： 10 9-10 2 IU/ml 应处在线性范围内、且均存在荧光信号的上平台。
3.重复性：取决于核酸提取方法与扩增效率。
（二）关于临界检测结果的漂移
例如，本场检测的时候，一个病人，一次检测是 53IU，一次是
七、关于内标
（一）实时荧光定量 PCR 无需内标
实时荧光定量 PCR 技术有效地解决了传统定量只能终点检测的局限，实现了每一轮循环均检测一次荧光信号的强度，并记录在软件之中，通过对每个样品 Ct 值的计算，根据标准曲线获得定量结果。
1.Ct 值的重现性：
PCR 循环在到达 Ct 值所在的循环数时，刚刚进入真正的指数扩增期（对数期），此时微小误差尚未放大，因此 Ct 值的重现性极好，即同一模板不同时间扩增或同一时间不同管内扩增，得到的 Ct 值是恒定的。
2.Ct 值与起始模板的线性关系：
由于 Ct 值与起始模板的对数存在线性关系，可利用标准曲线对未知样品进行定量测定，因此，实时荧光定量 PCR 是一种采用外标准与标本同步进行核酸提取的曲线定量方法。
（二）内标对实时荧光定量 PCR 的影响
若在待测样品中加入已知起始拷贝数的内标，则 PCR 反应变为双重 PCR，双重 PCR 反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显著。但由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。正因如此，定量方法虽然加入内标，仍为一种半定量方法。
美国 Texas 大学的科研人员进行了外标法定量和内标法定量的方法学比较，得出的结论是：内标法作为定量或半定量的手段是不可靠的，而外标准曲线的定量方法是一种准确的、值得信赖的科学方法。
AppliedBiosystems 公司的 7700 型实时荧光定量 PCR 仪是全球公认的荧光定量 PCR 的金标准，可实现多色荧光同时检测，但定量检测仍然采用外标准曲线的方法，而不用内标进行定量。
（三）内标对 PCR 扩增的影响
PPT34 显示的是内标对 PCR 扩增的影响。
左图，可以看到加入内标后线性范围变窄，无内标线性范围较宽。右图，无内标时是直线，有内标后，变成曲线。
个人建议：试剂盒在报批时，或使用单位对试剂盒质量进行评估时，使用内标对试剂盒性能进行评价！检定：正如 ELISA 试剂盒的批批检！
八、如何就分子诊断结果与临床和患者沟通？
医生和患者，都会对检验结果提出一些质疑。质量、速度应该还是个硬道理，应该权威的结果加虚心的请教。
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