PCRRFLP方法检测特定基因SNP及基因分型_pcrrflp基因分型方法

PCRRFLP方法检测特定基因SNP及基因分型由刀豆文库小编整理，希望给你工作、学习、生活带来方便，猜你可能喜欢“pcrrflp基因分型方法”。

PCR-RFLP方法检测特定基因SNP及基因分型

陆韵玲

（广东 广州 510303）

摘要：本实验随机抽取菜市场上的8头猪的猪肉，通过PCR-RFLP技术进行氟烷基因检测。结果表明，被检测到猪的基因型均为NN，未出现Nn和nn基因型，即市场上的猪肉是不含氟烷基因的。PCR-RFLP技术可准确诊断猪氟烷基因，在种猪选育过程中及时淘汰携带氟烷基因的个体，提高猪种质量。

关键词：PCR-RFLP；基因分型；SNP；氟烷基因

随着人民生活水平的不断提高，猪肉品质问题日益受到关注。SNP（Single Nucleotide Polymorpgism），单核苷酸多态性，指DNA发生了单个碱基的变异。这种变异可能会引起性状的改变或者导致疾病的发生。如猪的兰尼定受体（Rynodine receptor, RYR1）基因CDS序列第1843位碱基“C”突变为“T”，使蛋白第615位精氨酸（Arg,CGC）变成了半胱氨酸（Cys, TGC），引起蛋白结构和功能改变，这种改变能够引起猪的应激敏感综合征。猪在应激情况下，如长途运输、屠宰等，会对应激原刺激过度敏感，猪呼吸急促，心跳亢进，肌肉僵直，机体内水、电解质代谢紊乱，甚至突然死亡。对于商品猪而言，会导致猪肉质量严重下降，如肌肉苍白、质地疏松和有液体渗出等，大大降低了猪肉的经济价值。而氟烷基因是导致猪的应激敏感综合征的主效基因之一[1]。其杂合子（HalNn）虽然在生产性能上有一定优势，但其隐性纯合子（Halnn）是导致发生猪应激综合征。

本试验采用PCR-RFLP技术对随机取自市场的8头猪进行氟烷基因检测，旨在研究氟烷基因对猪的影响，以及检测市场上猪肉的品质。实验材料与方法

1.1实验材料

8头猪的猪肉样本（来自广东第二师范学院附近的市场）。

1.2实验试剂

（1）PCR反应相关试剂：含有镁离子的PCR缓冲液，特定的上下游引物，dNTP，Taq DNA聚合酶，灭菌双蒸馏水。（2）凝胶电泳相关试剂：琼脂糖，100×TAE或者100×TBE

缓冲液等，DNA分子量标准，上样缓冲液（6×Loading buffer），溴化乙锭（EB）或者替代物。（3）酶切相关试剂：HhalI限制性内切酶，酶切缓冲液，等。

1.3实验方法

1.3.1猪基因组DNA提取及琼脂糖凝胶电泳检测

取200mg猪肉组织样本，剪碎，置于1.5mL离心管中，加入裂解液650μL,蛋白酶K25μL，混合均匀，50℃恒温孵育14~20h，直到看不到组织块，加入Tris饱和酚400μL，氯仿384μL，异戊醇16μL，室温震荡10~15min，12000r离心10min。取上清液于1.5mL离心管，加入700μL异丙醇（与上清液体积相当），轻轻晃动，直至白色絮状DNA出现，12000r离心10min。弃上清，留沉淀，75%乙醇漂洗，再离心，弃上清，加100μLddH2O（灭菌双蒸水）。

配制1%琼脂糖凝胶，待胶凝固后，取1μL DNA溶液与5μL上样缓冲液混匀后加入点样孔，将胶放在电泳槽内，200V电泳15~20min后将凝胶取出放在紫外灯下观察并拍照，亮橘色条带表明DNA提取成功。

1.3.2猪HAL基因的PCR扩增及琼脂糖凝胶电泳检测

猪HAL基因的结构分析： 登录GenBank查阅获得猪HAL基因序列，分析并设计引物，目的片段包括含有CDS序列第1843位碱基。目前，两条特异引物已经广泛用于检测猪HAL基因，该对引物位于第16和18内含子上，PCR扩增范围包括了HAL基因的第17外显子，具体如下：

上游引物：5’ TCCAGTTTCC CACAGGTCGT ACCA 3’ 下游引物：5’ ATTCACCGGA GTGGAGTCTC TGAG 3’

已有文献报道扩增产物为659bp，根据登录的参考序列，扩增产物实际为660bp。引物由生物公司合成。

PCR反应体系的配制：按照如下比例配制，反应体积为20 μL。各成分的初始浓度和用量如下表1：

表1 PCR反应体系（20μL）

成分

10×Buffer含Mg2+）dNTPs Taq DNA聚合酶 上游引物

最初溶度或者含量 10× nM/mL

体积(μL)2 1.6 0.2 0.4

下游引物 DNA模板 ddH2O 总体积nM/mL 50 ng/μL

0.4 0.4 15 20 在配制上述溶液时，一般将除了DNA模板外的所有成分混合，均匀分装到灭菌的用于PCR扩增的Ep管中（0.2 mL规格）。在分装好的Ep管中加入DNA模板，盖紧盖子，瞬时离心，使各成分混合均匀。

PCR反应程序: 设置如下PCR程序：首先95 ℃预变性5min，然后94 ℃变性30s，55 ℃退火30s，72 ℃延伸40s进行35个循环，最后72 ℃延伸5min后冷却到4 ℃。

PCR扩增片段的检测:配制2%琼脂糖凝胶，取3μL PCR反应产物与3μL上样缓冲液混匀将其点入梳孔中，同时在其中一梳孔中加入DNA分子量标准，80V电泳15min后，最后在紫外灯下或者凝胶成像系统下进行观察或拍照。1.3.3PCR产物的RFLP: 按HhaI内切酶说明书要求，取10uL PCR产物，10× Buffer 2uL，0.5uL HhaI内切酶(10U/uL)，加水至20uL，37℃温3h，3％琼脂糖凝胶电泳检测，并拍照。

2结果与分析

2.1猪基因组DNA提取琼脂糖凝胶电泳结果

提取的DNA检测结果如图1，条带为亮黄色，说明提取的基因组DNA含量较高且蛋白杂质含量较少。

2.2 PCR扩增氟烷基因琼脂糖凝胶电泳结果

氟烷基因PCR产物HhaI酶切结果见图2A。PCR扩增产物经测序其全长大部分为659bp。与GenBank[2]已发表的序列比对后，确认为目的片段。且目的条带清晰明亮且无杂带,表明目的基因扩增效果良好。

2.3氟烷基因Hhal酶切琼脂糖凝胶电泳结果

由图2 B可见，在各样品中均没有发现氟烷基因阳性纯合子（HaLnn）；而阴性纯合子（HaLNN）在样品中有4头。这是由于目的基因是含氟烷基因第1843位点、长度为659 bp的片段，HhaI内切酶可识别5-' GCG|C-3'序列，即正常氟烷基因（HalN）序列的第1843位点。酶切后进行电泳、染色,根据电泳图谱中的带型判断个体氟烷基因型。

基因型为HalNN时,由于第1843位碱基为胞嘧啶（C）而有酶切位点，因而PCR产物被酶切为493 bp和166 bp两部分，琼脂糖检测为2条带。如图2 B1，2，3，5条带。

基因型为Halnn时,由于发生了CyT的突变，酶切位点消失，PCR产物为659 bp不变，琼脂糖检测为1条带。

基因型为Halnn杂合子时，琼脂糖检测为659 bp、493 bp和166 bp 3条带。而图2 B4，只有一条亮带，在2000bp处，说明该DNA氟烷基因Hhal酶切不成功，该条带实验失败。

图1 猪基因组DNA提取琼脂糖凝胶电泳结果

图2 实验结果

A：PCR扩增氟烷基因琼脂糖凝胶电泳结果

B：氟烷基因Hhal酶切琼脂糖凝胶电泳结果(M-DNA marker B1,2,3,5-阴性 B4-实验结果失败)3讨论

猪应激综合征检测的传统方法是用氟烷麻醉法，但该方法不能识别杂合子和阴性猪，且操作误差较大。而通过提取DNA利用PCR-RLFP进行检测，可以准确地检测出纯合子和杂合子，这样就克服了用氟烷检测费时、费力而且不能测出杂合子的弊端。本实验进一步验证了该技术在试验过程快速，简便。结果更科学准确，且对猪的创伤性小，节省人力，物力和时间。

此外，国外一些专家认为氟烷基因的存在弊大于利，因此近年来国外一些育种公司纷纷推出无氟烷基因的种猪。但我国学者对此持不同观点。上海农科院的屠宰试验已经初步证明,Nn基因型比NN基因型在瘦肉率、眼肌面积等方面更具优势,这与蒋思文报道的结果一致[3]

。但是，现代的育种手段还不能准确定位和分离及其遗传规律，对瘦肉率的选择更多的依靠常规育种。所以在种猪的选择过程中，携带氟烷阳性基因的猪种容易被选种，使得Haln基因在群中的扩增，给养殖业带来巨大的经济损失。

本实验虽然所检测的猪基本不含氟烷基因，但是，由于样本量少，不能全面地说明问题。另外，实验存在实验误差及有实验的结果是失败的。所以，实验存在很多可以改进的地方，例如：在取样时，能够给不同的猪编号，以防后面实验样本是取自同一头猪的；在提取DNA时，要尽量提高提取出的DNA的纯度，使后面的实验效果更明显。

参考文献：

[1]刘锐.嘉兴市凤桥镇猪氟烷基因检测对PSE肉的影响[J].江苏农业科学, 2011, 39(2): 298-300.[2] Brenig B, Brem G.Molecular cloning and analysis of theporcine/halothane0gene.Arch.Tierz., Dummerstorf 3215,1992.129~135 [3]蒋思文,熊远著,邓昌彦等.猪RYR1基因的PCR-RFLP分析和氟烷基因利用的研究.中国畜牧杂志,1997,33(2):9-10