生物化学实验报告：Western blotting检测大肠杆菌重组蛋白_生化蛋白测定实验报告
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实验三 Western blotting检测大肠杆菌重组蛋白
一、实验目的利用Western Blotting技术，定性（或定量）检测苦荞黄酮醇合酶基因（Flavonol synthase gene, FtFLS）在大肠杆菌表达宿主菌Escherichia coli BL(DE3)中的诱导表达。
二、实验原理
黄酮醇合酶（FLS，EC 1.14.11.23）属于2-ODD家族，催化黄酮醇合成支路中最后一步氧化反应，也是直接合成黄酮醇的反应。FLS可以使二氢黄酮醇在C3链中C2和C3之间氧化形成双键，从而生成黄酮醇：a Dihydroflavonol + 2-oxoglutarate + O2 a Flavonol + succinate + CO2 + H2O。
本实验采用PCR的方法，在苦荞黄酮醇合酶基因（FtFLS）ORF起始密码子前引入Kpn І酶切位点，去掉终止密码并引入BamH І酶切位点。克隆引入酶切位点后的FtFLS到表达载体pET-30b(+)质粒中，其表达产物分别在N-末端和C-末端各含有6 × His标签。重组质粒（pET-30b(+)-FtFLS）经鉴定后转化表达宿主菌E.coli BL21(DE3)并使用IPTG进行诱导表达。收集诱导0 h、2 h、4 h、6 h和8 h的产物，经SDS-PAGE后用于考马斯亮蓝R-250染色或Western blotting分析。
Western blotting的标准流程如下：蛋白质首先通过SDS-PAGE胺凝胶电泳分离，通过电泳转移到固相支持物上（硝酸纤维素膜、PVDF膜和尼龙膜）；将膜上未反应的位点封闭起来，以抑制抗体的非特异性吸附，固定的蛋白质即可与特异性的多克隆或单克隆抗体相互作用并通过放射、生色或化学发光的方法进行定位。
本实验采用小鼠抗聚组氨酸单克隆抗体（Anti-His tag IgG，一抗）与重组FtFLS蛋白的N-末端和C-末端6 × His发生抗原-抗体特异反应，再利用辣根过氧化物酶标记羊抗小鼠IgG（peroxidase-Goat Anti-Mouse IgG，二抗）与一抗发生特异结合，最后使用DAB进行显色。DAB即：二氨基联苯胺（3, 3'-diaminobenzidine），是过氧化物酶（Peroxidase）的生色底物。DAB在过氧化氢的存在下失去电子而呈现出颜色变化和积累，形成浅棕色不溶性产物。该方法常用于检测过氧化物酶的活性，它灵敏度高，特异性好，在免疫组化，原位杂交，Western blotting等膜显色中 1
应用广泛。
三、操作步骤 3.1 样品的制备
原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测大肠杆菌重组蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。
材料与试剂：
重组pET-30b(+)-FtFLS质粒、表达宿主菌E.coli BL21(DE3)、LB固体培养基（Kan 50μg/mL）、LB 液体培养基（10mL、50mL）、Kan（50 mg/mL）、IPTG（24 mg/mL）、PBS缓冲液、5 X SDS上样缓冲液。仪器与设备：
恒温培养箱、恒温摇床、超净工作台、酒精灯、消毒酒精（75%）、棉球、接种环、台式离心机、冰盘、Tip（10 μL、200 μL、1 mL）、微量加样器（10 μL、200 μL、1 mL）、离心管（1.5 mL、10 mL）。操作步骤：
①含重组质粒pET-30b(+)-FtFLS的表达宿主菌E.coli BL21(DE3)划线于LB 固体培养基（Kan抗性），37℃培养16 h。
②挑选单菌落，接种至10 mL LB培养基（按0.1%加入Kan，10 μL）于37 ℃过夜培养，即为种子液。
③按2 %的接种量（1 mL）将种子液接种到50 mL LB Kan培养基中（按0.1%加入Kan，50 μL），于37 ℃培养OD600至0.5（约2.5 h）。
④加入IPTG至终浓度为1 mmol/L（100 μL），置于25℃连续诱导表达8 h，分别取诱导前0 h，诱导后2 h、4 h、6 h和8 h的培养液5 mL于10 mL离心管中，置于冰水混合物上备用。
⑤诱导完毕后，各样品于8000 rpm（12000 rpm易爆管）离心5 min收集沉淀，用等体积PBS（5 mL）重悬漂洗细胞2次，收集菌体。
⑥各管分别加入400 μL PBS重悬细胞，加入100 μL 5 X SDS上样缓冲液，置于沸水浴中10 min（注意防止爆管）。注意事项：
①重组蛋白的诱导表达应进行正确的无菌操作并加入适宜浓度的抗生素，避免可能的污染。
②在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性。
③选择合适的表面活性剂和还原剂，破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价键二硫键。尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子。
④制备过程应在低温下进行，以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰。
⑤样品建议分装成合适的量（比如分装出20ul检测蛋白质定量用），然后保存与-20°或-80℃中长期保存，但要注意不要反复冻融，因为会使蛋白的抗原特性发生改变。3.2 SDS-PAGE SDS-PAGE（SDS变性不连续聚丙烯酰胺凝胶电泳）的分离原理则仅根据蛋白质的分子量的差异。因为SDS-PAGE上样缓冲液含有SDS和巯基乙醇（2-ME）或二巯基赤藓醇（DTT），其可以断开半胱氨酸残基之间的二硫键、分子内氢键、破坏蛋白质的高级结构、形成SDS-蛋白质复合物。该复合物形成榛状结构，平均每两个氨基酸残基结合一个SDS分子，使其带有大量的负电荷（蛋白质分子本身的电荷完全被SDS掩盖），从而消除了不同分子之间原有的电荷差别。材料与试剂：
① 分离胶缓冲液（1.5 mol/L Tris-HCl，0.4% SDS，pH 8.8）。② 浓缩胶缓冲液（0.5 mol/L Tris-HCl，0.4% SDS，pH 6.8）。
③ 30%丙烯酰胺/N, N'-亚甲基双丙烯酰胺（Arc/Bis）：29.2 g Acr，0.8 g Bis，定容至100 mL。
④ 10%过硫酸铵（W/V），需新鲜配制。
⑤ 2 X 上样缓冲液（pH 8.0）：含0.5 mol/L Tris-HCl（pH 6.8）2 mL，甘油2 mL，20% SDS 2 mL（W/V），0.1%溴酚蓝 0.5 mL，2-β-巯基乙醇（2-ME）1.0 mL，定容至10 mL。
⑥ 电极缓冲液（pH 8.3）：3.03 g Tris，14.41 g Gly，1.0 g SDS，调整pH后定容至1000 mL。
⑦ 染色液：45%甲醇，10%乙酸，0.25%考马斯亮蓝R-250。⑧ 脱色液：10%（V/V）乙酸，5%（V/V）乙醇。⑨ 封底胶：1g琼脂糖溶于100 mL电极缓冲液。⑩ 预染标准分子量蛋白质Marker。仪器与设备：
垂直板电泳槽及其附件，电炉，电泳仪，微量加样器（10 μL），Tip（10 μL）。操作步骤：
① 电泳槽的安装：将成套的两块玻璃板正确放入硅胶条中，夹在电泳槽里，按对角线顺序旋紧螺丝（注意分辨上下槽）。用1%的琼脂糖封底（封于下槽底部），待琼脂糖凝固后即可制胶。
② 制胶：选择合适的胶浓度，按下表配制分离胶，灌入两玻璃板之间，加至距短玻璃板顶端3 cm处，立即覆盖5 mm左右水层，静置等待聚合，当分离胶与水层之间的界面重新出现时表明胶已聚合。小心倒掉分离胶上水层，配制浓缩胶后加入玻璃板中，插入梳子并及时补充由于浓缩胶聚合产生的空隙（该过程避免气泡的产生）。
本实验选用12.5%的SDS-PAGE胶对重组FtFLS进行分离。
试剂 浓度 分离胶缓冲液 mL 浓缩胶缓冲液 mL Acr/Bis mL
分离胶
7.5% 10% 12.5% 15% 4.05.3
4.08.0
30% 4.01.25 0.75 4
H2O mL 10% AP mL TEMED mL
8.0 0.3
6.7 0.3
5.3 0.3
4.0 0.3
1.3 0.3
3.0 0.15 0.005
0.008 0.008 0.008 0.008 0.008 ③ 点样：分别在上下电泳槽中倒入电极缓冲液，上槽淹没短玻璃板，下槽淹没电极即可。此时，小心拔出梳子，用微量加样器调整点样孔之间的浓缩胶（此步骤应检查电泳槽是否漏液）。使用微量进样器分别在样品槽内分别加入预染的标准分子量蛋白质、诱导前0 h，诱导2 h、4 h、6 h和8 h后处理好的样品18 μL（上样总体积一般不超过15 μL，加样孔的最大限度可加20 μL样品）。
④ 电泳：接通电源，调节电压至100 V，恒压电泳；待指示剂进入分离胶后，调节电压至200 V恒压电泳。待指示剂在分离胶中迁移5-6 cm左右时，停止电泳。剥胶：小心剥胶，将浓缩胶（浓缩胶影响操作）和分离胶上不用的部分切去（便于识别），见图3和图4.⑤ 染色：凝胶经蒸馏水漂洗1次后加入染色液，电炉加热处理10-20 min染色。⑥ 脱色：使用蒸馏水漂洗取出染色液，加入脱色液，电炉加热脱色至出现清晰的蛋白条带。注意事项：
①上样总体积一般不超过15L，胶孔的最大限度可加20L样品。
②微量加样器应贴壁吸取样品，避免吸进气泡；将微量加样器Tip头插至加样孔中缓慢加入样品，避免样品溢出。
③电泳设备应注意检查正负极、是否短路或接触不良、是否漏液、电流电压大小（电流强度会随电泳的进行有所降低）。
④电极缓冲液和AP应新鲜配制，上下槽缓冲液不可混用（电泳完毕分别收集）。3.3 转膜与杂交
杂交膜的选择是决定Western blotting成败的重要环节。应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。
用于Western blot 的膜主要有两种：硝酸纤维素膜（NC）和聚偏氟乙烯（PVDF）膜。NC膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，但在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被洗脱下来。根据被转移的蛋白分子量大小，选择不同孔径的NC膜。因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。通常用0.45 μm和0.2 μm两种规格的NC膜。大于20 kDa的蛋白可用0.45 μm 的膜，小于20 kDa的蛋白用0.2 μm的膜。PVDF 膜灵敏度、分辨率和蛋白亲和力比常规的膜要高，非常适合于低分子量蛋白的检测。但PVDF 膜在使用之前必需用纯甲醇浸泡饱和1-5 sec。蛋白质常用的转移方法主要有两种：槽式湿转和半干转移。前者操作容易，转移效率高；而后者适用于大胶的蛋白转移，所用缓冲液少。以下为槽式湿转的操作步骤。材料与试剂：
材料：PVDF膜，Whatman 滤纸，搪瓷盘，一次性PE手套，镊子，玻棒，试剂：转移缓冲液 pH 8.3（25 mmol/L Tris，0.2 M 甘氨酸，20%甲醇），1000 mL 10 X TBS缓冲液pH 7.6（24.2 g Tris base，80 g NaCl，用1N HCl调pH=7.6），脱脂奶粉、BSA或试剂盒自带的蛋白质干粉，洗涤缓冲液（1 X TBS，0.1% Tween-20），封闭缓冲液（1×TBS，0.1% Tween-20，5% w/v脱脂奶粉或BSA），抗体稀释液[1×TBS, 0.1% Tween-20 加5% BSA（多抗）或5%脱脂奶粉（单抗）]。仪器与设备：
转膜电泳仪及其附件，杂交仪，培养皿，凝胶成像系统。操作步骤： 转膜
① 准备转移缓冲液，依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，将凝胶和PVDF膜和滤纸放入转移缓冲液中平衡10min。
② 装配转移三明治（海绵→3层滤纸→胶→膜→3层滤纸→海绵）：在加有转移液的搪瓷盘里放入转膜用的夹子、两块海绵垫、一支玻棒、滤纸和浸过的膜；将夹子打开使一面保持水平（规定为正极）。在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以
擀走里面的气泡。在垫子上垫三层滤纸，一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。依次加膜、加胶，再在膜上盖3张滤纸并除去气泡，见图5。
③ 将转移槽置于冰浴中，放入三明治，加转移缓冲液，插上电极，100V电泳1h（电流约为0.3 A）。
④ 电泳结束，观察预染的蛋白质Marker是否转移到膜上。杂交
① 用25-50 mL洗涤缓冲液洗涤硝酸纤维素膜5 min, 1 次。
② 封闭硝酸纤维膜：加封闭缓冲液25 mL，37℃封闭2 h。用量以浸没整张膜为准，图6。
③ 抗体的稀释（已依稀）：小鼠抗聚组氨酸单克隆抗体使用100 μL抗体稀释液进行溶解稀释，储存与4℃。（一般特异性抗体浓度1 μg/mL）
④ 硝酸纤维膜孵育一抗：加入20 mL抗体稀释液，将25 μL一抗加入培养皿中（已完全覆盖膜为准），37℃孵育2 h左右，见图7和图8。（视实验时间，也可以4℃孵育过夜）
⑤ 用25 mL洗涤缓冲液振荡洗涤硝酸纤维素膜3 次, 每次5 min。
⑥ 硝酸纤维膜孵育二抗：加入25 mL抗体稀释液，将25μL二抗全部加入培养皿中（以完全覆盖膜为准），37 ℃孵育2 h，见图7和图8。
⑦ 用30 mL洗涤缓冲液振荡洗涤硝酸纤维膜4 次, 每次5 min。
⑧ DAB 显色：按每2 mL蒸馏水加显色剂A，B，C 各１滴，混匀。混匀后加至膜上。室温显色。一般显色1－30 分钟。若无背景出现则可继续显色。显色后用蒸馏水洗涤以终止反应。注意事项：
①操作中戴手套，不要用手触膜。
②如检测小于20 kDa的蛋白应用0.2μm的膜，并可省略转移时的平衡步骤。③某些抗原和抗体可被Tween-20 洗脱，此时可用1.0% BSA代替Tween-20。④关于封闭剂的选择：5%脱脂奶/TBS or PBS: 能和某些抗原相互作用，掩盖抗体结合能力；0.3~3% BSA in PBS：低的内源性交叉反应性。
⑤如用0.1% Tween 20、0.02% NaN3 in PBS or TBS作封闭剂和抗体稀释液，抗体检测后可进行蛋白染色。
⑥如要同时检测大分子量和小分子蛋白，最好用梯度胶分离蛋白。
四、实验结果
4.1 考马斯亮蓝显色结果
4.2 DAB显色结果
五、讨论与分析
1.考马斯亮蓝显色结果
由图可知，其变化趋势是目的条带颜色越来越深，条带宽度也逐渐变宽。说明随着培养时间推移，产生的目的蛋白越来越多，也就意味着转入的基因得到表达。而目的条带宽度在6h以后变化已经不明显，说明此时目的蛋白的表达已达到接近峰值。实验结果的背景色偏深，但还不影响结果的判定。2.DAB显色结果
由于显色结果并不理想，不能清晰反映我们实验设计所需要的结果。上图显色结果为绘制的示意图。主要可能是因为一抗孵育时间较短导致，也可能是由于蛋白样品本身上样量不足或蛋白浓度较低，以及转膜转印效率不够高。另外，也可能由于以下这些方面没有严格做到影响了实验结果：
A制作凝胶时，严格按照配方制作，倒胶时做到既快又稳，防止产生气泡。同时，制胶前应洗净玻板并使其完全干燥，否则会影响实验结果。
B进入杂交阶段，重要的是控制温度和孵育时间，在孵育之前，封闭也是必不可少的步骤。显色效果与各个步骤都是密不可分的，但一抗、二抗品质与用量尤为重要。这一步必须尤为仔细。
C 当进入转膜阶段时，注意转移三明治的顺序，海绵、滤纸、胶、膜，滤纸，海绵。还需要注意的是一定要驱赶完海绵里的气泡，不然会造成短路。
D为提高实验准确度样品应按照以下标准：样品不能反复冻融，样品未加蛋白酶抑制剂。同时，建议检查Western Blot过程，提高抗浓度。对于加蛋白酶抑制剂来说，一般加PMSF就可以了，最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。
