牛奶中阿维菌素类药物残留检测——高效液相色谱法(SOP)修改版新_阿维菌素检验sop
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牛奶中阿维菌素类药物残留检测—高效液相色谱法安全要求
该检验的提取、净化步骤应在通风橱中进行，操作中需着工作服、戴口罩手套，避免溶剂气体吸入和皮肤接触；废弃的化学试剂收集到专用容器集中处理。急救措施
皮肤触到有机溶剂或酸,用清水清洗，溅入眼中用纯水灌洗。适用范围
该操作规程适用于牛奶中阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素残留量的制样及测定。职责
进行该项检验的检验员必须按该操作规程进行检验，质量监督员负责监督该操作规程的正确执行。检测原理
用乙腈提取试料中残留的阿维菌素类药物，加水稀释，加三乙胺使溶液呈弱碱性，C18固相萃取柱净化，加三氟乙酸酐和N-甲基咪唑衍生化。高效液相色谱-荧光检测法测定，外标法定量。方法灵敏度
本方法在牛奶中阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素的检测限均为1µg/kg，定量限均为2µg/kg。注意事项
7.1 整个净化步骤控制C18柱流速约在1～2 mL/min； 7.2 C18柱使用过程中除特别说明外，应避免柱床干涸。材料、仪器、试剂的准备及基本要求
除特别注明外，以下所用试剂均为分析纯；水为超纯水。8.1 阿维菌素标准品
含量≥95.7% 8.2 多拉菌素标准品
含量≥92.6% 8.3 伊维菌素标准品
含量≥93.9% 8.4 乙腈
色谱纯 8.5 甲醇
色谱纯 8.6 三氟乙酸酐 8.7 三乙胺
8.8 异辛烷
8.9 N-甲基咪唑
8.10 C18固相萃取柱 500 mg/6 cc，或相当者
8.11 固相萃取柱洗涤液；取乙腈30 mL、水70 mL和三乙胺20 µL，混匀。8.12 衍生化试剂
a)A液：N-甲基咪唑-乙腈（1+1，v/v）。现用现配。b)B液：三氟乙酸酐-乙腈（1+2，v/v）。现用现配。8.13 1 mg/mL 阿维菌素类药物混合标准贮备液：
分别称取阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素标准品10 mg，精密称定，于10 mL量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度。配制成阿维菌素类药物浓度为1 mg/mL的混合标准贮备液，-20℃保存，有效期6个月。
8.14 10 µg/mL 阿维菌素类药物混合标准工作液：
准确量取混合标准贮备液0.25 mL，于25 mL量瓶中,用乙腈稀释并配制成阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素浓度为10 µg/mL标准工作液。-20 ℃保存，有效期1个月。8.15 1 µg/mL 阿维菌素类药物混合标准工作液：
准确量取10 µg/mL阿维菌素类药物混合标准工作液2.5 mL，于25 mL量瓶中,用乙腈稀释配制成阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素浓度为1 µg/mL标准工作液。-20 ℃保存，有效期1个月。
8.16 高效液相色谱仪（配荧光检测器）8.17 分析天平
感量0.00001 g 8.18 天平
感量0.01 g 8.19 振荡器
8.20 离心机 8.21 涡旋混合仪
8.22 聚丙烯离心管
mL
8.23 氮吹仪
8.24 C18固相萃取柱 500 mg/6 cc，或相当者 8.25 微孔滤膜
0.45 µm 检验步骤 9.1 试料的制备
9.1.1 取混匀后的供试样品，作为供试试料。
9.1.2 取混匀后的空白样品，作为空白试料（阴性对照）。
9.1.3 取混匀后的空白样品5 g,添加1 µg/mL的工作液0.05 mL，作为空白添加试料。
9.2 标准曲线的制备
精密量取1 µg/mL阿维菌素类药物混合标准工作液0.02、0.05、0.1 mL，于10 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度；精密量取10 µg/mL阿维菌素类药物混合标准工作液0.25 mL，于50 mL量瓶中，0.1、0.3 mL至10 mL量瓶中，用流动相稀释至刻度，配制成浓度分别为2、5、10、50、100、300 ng/mL的阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素混合标准溶液，各取1.0 mL于各自的10 mL试管中，于50 ℃水浴氮气吹干，按衍生化步骤处理后，将系列标准溶液，供高效液相色谱测定，从低浓度到高浓度依次测定，每一浓度进样3针。以测得峰面积为纵坐标，对应的标准溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。求回归方程和相关系数。
9.3 提取
9.2.1 称取(5±0.05)g试料，于50 mL离心管中，加乙腈8 mL，涡旋混匀，中速振荡5 min，5000 r/min离心10 min。
9.2.2 收集上清液于另一50 mL离心管中。残渣再重复提取一次。9.2.3 合并两次上清液，加水15 mL和三乙胺50 µl，混匀，备用。9.4 净化
9.4.1 依次用乙腈5 mL、固相萃取柱洗涤液5 mL，活化C18固相萃取柱。9.4.2 将备用液过柱，抽干。加异辛烷3 mL洗涤，抽干。
9.4.3 用乙腈5 mL洗脱。收集洗脱液于10 mL试管中，50 ℃下用氮气吹干。备用
9.5 衍生化
向试管中依次加入衍生化试剂A液100 µL和衍生化试剂B液150 µL，密闭，涡动10 s，依次加冰醋酸、三乙胺各50 µL，涡动10 s，密闭反应30 min，加650 µL甲醇混匀。经0.45 µm微孔滤膜过滤，供高效液相色谱检测。
9.6 测定 9.6.1 色谱条件
9.6.1.1 色谱柱：C18柱，（250×4.6 mm，粒径5 µm）；或相当者； 9.6.1.2 流动相：乙腈+水（90+10，v/v）；
9.6.1.3 流速：1.8mL/min；
9.6.1.4 检测波长：激发波长： 365 nm，发射波长：475 nm； 9.6.1.5 柱温：40 ℃； 9.6.1.6 进样量：20 µL。9.7 测定法
9.7.1 试样溶液和50 ng/mL的标准溶液，作单点校准，以峰面积计算。标准溶液及试样溶液中阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素的响应值均应在仪器检测的线性范围之内，试样溶液测定过程中应参插注入标准溶液，以便准确定量。空白、添加、标准溶液高效液相色谱图见附录及附加说明。9.7.2 试剂空白试验
除不加试料外，采用完全相同的测定步骤进行平行操作。9.8 结果计算和表述
试料中阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素的残留量（μg/kg），按下式计算：
X = 式中:
X
——试料中相应的阿维菌素类药物的残留量，μg/kg； C
——试样溶液中相应的阿维菌素类药物的浓度，ng/mL； V
——衍生化后试样的总体积，mL； m
——供试试料的质量，g。
注：计算结果需扣除空白值，测定结果用平行测定的算术平均值表示，保留三位有效数字。9.9 结果判定
CV m9.9.1 线性范围
阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素在2～300 ng/mL范围考察线性，计算回归方程，其相关系数应≥0.995。9.9.2 准确度
本方法在2～50 μg/kg添加浓度的回收率为70～120 %。9.9.3 精密度
本方法的批内相对标准偏差≤15%，批间相对标准偏差≤20%。9.9.4 判定
当方法学考察结果符合上述规定时，供试组织中阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素的残留量单个及之和Xi＜检测限时，判定为未检出；方法检测限≤Xi＜最高残留限量时, 判i1i1nn定为符合规定； Xi1ni≥最高残留限量时，判定为不符合规定。
注：仅当Xi≥方法检测限时，Xi为参与阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素总残留量求和计算，故求和公式中0≤n≤3。
9.10 附录及附加说明
阿维菌素、多拉菌素和伊维菌素在牛奶中的最高残留限量
药物名称 阿维菌素 多拉菌素 伊维菌素
标志残留物 阿维菌素
多拉菌素 22，23-二氢伊维菌素
动物品种
牛 牛 牛
组织
奶 奶 奶
MRL（µg/kg）不得检出 不得检出 10
附 录 A（资料性附录）高效液相色谱图
LU ***00510152025
图A.1 牛奶空白色谱图
minLU ***200510152025min
图A.2
阿维菌素类药物标准溶液色谱图（50 ng/mL）
LU ***020510152025min3
图A.3 牛奶中空白添加阿维菌素类药物色谱图（10 ng/g）
图中色谱峰: 1-阿维菌素；2-多拉菌素；3-伊维菌素。
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