HBV准种检测及相关实验技术_实验室检测常用技术

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HBV准种及相关检测实验技术

韩 军M201375681同济医院感染科 摘要：乙型肝炎病毒(HBV)以准种形式存在于宿主体内 HBV准种的变化影响患者的临床表现及疗效，从准种角度了解进化特点以及准种与耐药发生的关系将有利于预测疗效克服耐药以及研发新的抗病毒治疗手段等 HBV准种的实验诊断技术水平直接关系到HBV准种的研究进展，高敏感性和高特异性的准种实验诊断方法的引入将对HBV准种的研究具有重要意义。

关键词:乙型肝炎病毒；准种；实验诊断

准种（quasispecies）是由艾根（Eigen）首先提出用于描述同种生物遗传异质性的概念，它特指不同病毒种群间有一定基因序列差异即基因异质性（差异一般不超过核苷酸序列总长度2%～5%），但尚不构成病原体不同基因型或血清型的现象。自然状态下，准种通常由一种或几种主序列以及一系列变异序列组成，当选择压力平衡时可维持相对稳定。乙肝病毒（HBV）具有的准种特性可能是引起乙型肝炎慢性化和抗病毒治疗失败的一个非常重要的病毒学因素。HBV准种概念的提出，为全面认识HBV提供了新的角度，使人们对HBV存在状态的认识产生了两个重要的飞跃：从单一病毒到病毒群的飞跃以及由静态到动态变化的飞跃。

1.HBV准种特点

随着研究的深入，人们逐渐发现HBV准种具有以下特点: 1.HBV准种普遍存在于CHB患者体内。2.HBV准种指的是一个病毒群体而非单一的病毒，各病毒之间遗传同源又存在微小差异。3.HBV准种病毒间的微小差异可见于HBV全基因序列，以HBVC区S区核心启动子等免疫攻击主要靶位尤为多见。4.HBV存在cccDNA池和RC-DNA池(relaxed circular DNA)两个准种群。5.外界环境变化时HBV准种中的劣势病毒群可漂变为优势病毒群。6.疫苗和抗病毒药物的使用不会抑制HBV准种的形成，只会加速HBV的突变和进化。7.HBV准种与乙型肝炎慢性化肝癌的发生HBV免疫逃逸HBV耐药等密切相关。由于HBV准种的以上特点，人们

在近年来疾病转归耐药克服和更合理的抗病毒治疗方案的研发中更加关注HBV准种现象。

2.HBV准种与临床

目前常用的抗病毒药物主要有拉米夫定阿德福韦酯恩替卡韦替比夫定等，其中拉米夫定5年耐药率可达60%～70%［1］，拉米夫定耐药后常采用联合阿德福韦酯或恩替卡韦治疗［2］，恩替卡韦治疗5年的基因型耐药率为1.2%，临床耐药率为0.8%［3］。HBV耐药除了与HBV RT区相关外，Chen等［4］还发现，HBVS C基因中决定T细胞和B细胞表位的核苷酸变化可导致耐药 Moriconi 等［5］指出，拉米夫定单一治疗产生的HBV准种现象会影响阿德福韦酯治疗疗效，并降低病毒对其他核苷酸类似物的敏感性 外界压力下，准种中的劣势病毒群不一定完全消亡由于基因漂变的作用，原有耐药株在补救治疗中成为劣势病毒群后仍有可能累积成优势病毒群［6］。在一些补救治疗或序贯疗法中，短时间内HBV野生株可替代耐药株成为优势株，但提高扩增效率仍可检测到耐药株，随着治疗的持续，原耐药株仍会被筛选出来，甚至会在原有耐药株基础上出现交叉耐药株和多重耐药株而导致治疗失败［7］。

虽然，HBV耐药是无法逆转的，但在耐药发生前能够预测 Pallier等［8］发现一些耐药性突变在发生病毒学突破前几个月就能检测出来，耐药性突变随着抗病毒治疗的进行而逐渐演化，最终转变为优势病毒群而导致治疗失败 有研究表明，抗病毒治疗4周时HBVRT区的准种变化一定程度上可以预测拉米夫定或恩替卡韦的治疗疗效［9-10］.HBV准种群中优势准种决定药物的敏感性，劣势准种储备耐药潜力［11］，临床上若将HBV优势种群与抗病毒药物敏感性联系起来，将有利于患者的个体化治疗。因此，在抗病毒治疗过程中对准种的动态监测相对于单纯的HBVDNA定量检测具有更重要的临床应用价值。

准种的动态监测打破了抗病毒治疗管理的常规思想，它可以早期预测抗病毒疗效，有效的准种动态监测和治疗干预一定程度上能避免耐药株的积累 由于一些决定HBV T细胞B细胞表位的核苷酸变化也可导致耐药，抗病毒治疗过程中的准种的动态监测不应仅局限于HBV RT区，对HBV基因全长的准种的动态监测似乎更为合理，而对准种的动态监测也主要包括准种的复杂度多样性以及进化率等方面.3.HBV准种常用实验诊断方法

当前，特异性好敏感性高的准种检测方法对于克服HBV相关问题有重要意义，常用的检测手段主要有以下几种:

3.1 直接测序法

该法是检测病毒突变的金标准，对聚合酶链反应(polymerase chainreaction，PCR)产

物进行直接序列分析，并与DNA序列进行对比 该方法检测结果可靠，但是费时费力费用高，尤其不适用于患者长期抗病毒治疗过程中反复多次的检测，更重要的是，只有当序列改变的DNA比例超过HBVDNA的15%以上，测序才能够检测出来,不能准确地反映准种中优势与劣势种群的情况和抗病毒治疗过程中HBV准种的进化模式。

3.2 PCR-单链构象多态性

单链构象多态性(singlestrandconformationpolymorphism，PCR-SSCP)也可区分多个准种，可以根据条带数直接反映准种的复杂度，对于小片段(＜300bp)的缺失突变检测具有广阔的应用前景，但敏感性不高，稳定性也较差。

3.3 异源双链泳动分析法

异源双链由于存在碱基不匹配区域，当异源双链中发生碱基错配时，DNA分子的双螺旋构象就会发生改变，在电泳时的移行速度就会发生改变 异源双链的同源性越高，泳动越快，反之则慢 ,该法操作简单快速，常用于基因亚型的测定，但该方法敏感性不高。

3.4 构象敏感凝胶电泳法

此方法是改进了的异源双链泳动分析法(heteroduplex mobility aay，HMA)法，它把SSCP和HMA两种方法集成在一张聚丙烯酰胺凝胶上，在聚丙烯酰胺凝胶中加入了适量的温和变性剂从而增强异源双链分子的构象差异提高检出的敏感性 该法拥有SSCP和HMA两者的优点，比SSCP能够检出更大片段和提供更多的准种信息，比HMA更敏感［12］。

3.5 基因芯片技术

此方法是利用核苷酸杂交原理建立起来的一种高度集成化并行化多样化微型化和自动化的基因检测技术，它将大量探针分子固定于支持物上后与标记的样品分子进行杂交，通过检测每个探针分子的杂交信号及强度，进而获取样品分子的数量和序列信息 基因芯片具有高通量和可以根据研究结果调整探针的类型和数量的特点，适合于准种的检测［13］。

3.6 质谱技术

用电场和磁场将运动的离子(分子或原子)按它们的质荷比分离后进行检测，即可测出不同质荷比的谱线即质谱，通过质谱分析，可获得离子(分子或原子)的准确质量分子式分子结构等信息 由于核素的准确质量是多位小数，不会有两个一样的核素质量，也不会有另一核素质量整数倍的核素质量，质谱分析法具有较高的特异性和敏感性，可用于准种分析［13］。

3.7 终点有限稀释PCR技术

将检测的DNA系列稀释，每个稀释度进行多个PCR，当PCR阳性数占该稀释度PCR总数的25%或以下时，该浓度则称为终点浓度，在此浓度进行的PCR称为终点PCR，反映的是单个DNA分子进行的PCR 该方法能够实现对单个分子分开扩增，减少错误率的同时能敏感检测出DNA的变异，可用于准种的检测［14］。

3.8 第二代测序技术

第二代测序技术(如Roche454GSFLXSolexa和SOLiD等)直接通过聚合酶或者连接酶进行体外合成测序，具有高通量和低成本的特点，主要包括以下几种技术: Roche454GSFLX采用焦磷酸合成测序法的原理［15］，将以往转化大肠埃希菌扩增质粒的过程用简单的体外PCR扩增法替代，每次运行能产生上100万条序列，平均读长能达到400nt，第400个碱基的准确度能达到99%，适合对未知基因组从头测序和一些细菌病毒基因组的研究 Solexa采用可逆终止子法［16］，读长片段75～100bp，准确度高达99%，适合小片段如miRNA的研究，由于其被掺入核苷酸标记的荧光探针或终止基因切除不完全会导致测序信号发生衰减和相移，使得Solexa在测序长度上存在缺陷，检测碱基替换插入或缺失突变时容易出错 SOLiD法采用双碱基编码的原理［17］，具有误差校正功能，读长25～50bp，准确度高达98%，适合比较基因组学的研究，如单链核酸多态性的检测等，由于其测序片段过短，该技术的应用也不够广泛,第二代测序技术准确率低于传统测序技术，但Prosperi 等［18］指出，Roche454GSFLX存在一定的误差,通过组合分析法，体外构建HBV准种的模拟值与真实值具有很好的一致性。结 语

HBV准种的研究虽然已取得一定成果，然而，由于抗病毒治疗过程中HBV准种的进化受多种因素影响，HBV的微小突变形式复杂多样，对HBV准种演变检测方法不够精确，这些因素阻碍了人们对慢性乙型肝炎的防治.因此，加快认识HBV准种的特点，改进和创新准种检测方法实属必要。

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