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目录

摘要...........1

关键词................1

1前言................1

1.1影响卵母细胞成熟培养的因素.......1

1.2卵母细胞的来源........2

1.2.1奶牛卵母细胞的成熟.............2

1.2.2牛卵母细胞体外成熟的方法.........3

1.3卵母细胞的成熟判断............3

2材料及方法..........3

2.1卵巢卵母细胞的采集........3

2.2成熟液的配置.............3

2.3成熟卵的检查.............4

3结果与分析..........4讨论................4

5结论................4

致谢...........4

参考文献..........5奶牛卵母细胞体外成熟培养的研究

摘要：为研究孕马血清促性腺激素(PMSG)在奶牛卵母细胞的成熟过程中的作用。在牛卵母细胞成熟液中添加 0、25μg/ml、50μg/ml、75μg/ml PMSG 统计成熟率。结果表明，添加 PMSG各组与对照组相比，卵母细胞的成熟率均显著提高。而添加 10μg/ml、25μg/ml、75μg/ml组卵母细胞的成熟率之间差异不显著，50μg/ml组卵母细胞的成熟率最高。

关键词：牛；卵母细胞；体外成熟

1前言

牛在大多数情况下是一胎一仔，自然双胎的概率很小。其根本原因在于：牛的卵巢大多数情况下每次只排 1个卵，因而只可能有一个胚胎产生，这极大地影响了牛的繁殖性能。而通过牛卵母细胞体外成熟技术能获得较多的卵子，与体外受精技术相结合，大大提高了牛的繁殖性能。Edwards在 1965年获得牛卵母细胞的体外成熟(in vitro maturation，IVM）培养的成功。1982年，Brackett 等人首次报道用手术法收集牛卵母细胞进行体外受精，并产下活犊的试验。其后Iritani和niwa在报道体外成熟的卵母细胞进行体外受精后，又相继报道了卵母细胞的体外培养、受精、移植和妊娠，产下活犊的试验结果。牛卵母细胞的IVM和 IVF技术在牛胚胎生产中有很大发展潜力。随着体外受精技术的发展，牛卵母细胞的体外成熟显得愈来愈重要。近年来，Bols等(1995)，Bungartz等(1995)和Niemann等(199

5)借助超声波横穿阴道从母牛卵巢吸取具有高的遗传性状的卵母细胞，经体外成熟、受精、培养以获得系谱清楚且具有高的可期望性状的胚胎。

随着哺乳动物体外受精、细胞核移植和外源基因导入等高新技术的不断深入,人们对成熟卵母细胞以及哺乳动物胚胎需求量日益增加，卵巢内丰富的卵泡资源是胚胎工程迅速发展的基础。通过卵巢卵母细胞体外成熟获取大量成熟卵母细胞，然后进行体外受精、体外生产胚胎愈来愈引起人们的注视。

1.1 影响卵母细胞成熟培养的因素

卵母细胞的成熟是一个复杂的，动态的过程，有许多代谢事件发生，除了进行积极的mRNAs转录、蛋白质合成外，还有其他一些物质的降解。在体外成熟培养中，通常以第一极体的排出来判断卵母细胞的成熟，其实这只是核成熟的标志。除了核成熟外，卵母细胞的胞质成熟也很重要，尤其是对用于核移植的卵母细胞而言，胞质的成熟直接关系到能否使供体核实现彻底的再程序化、重构胚能否维持正常的分裂发育。从这个意义上说，目前所用的卵母细胞成熟体系还不尽完善，一些对卵母细胞成熟和后续发育非常重要的物质不能完全合成。近年来，在卵母细胞体外成熟的研究中，人们的注意力主要集中在提高体外成熟的卵母细胞支持胚胎发育的能力上。

卵母细胞体外成熟中应用最广泛，效果稳定的基础培养液是TCM199。在牛上，TCM199 添加10%血清、促性腺激素和雌激素，卵母细胞的成熟率可达到90%(Fukuda，1990)。小鼠卵母细胞的体外成熟在CZB及KSOMaa中也可得到很好的效果。猪的卵母细胞成熟除用TCM19外，NCSU-23也被较多使用，虽然成熟率差别不大，但在TCM199中培养成熟的猪卵母细胞可更好的支持受精卵向囊胚的发育。这些培养液中都要添加动物血清，由于血清成分的复杂和难以确定，它对卵母细胞的成熟及后续发育的影响也是复杂多元的，这一点近年来倍受关注，因此人们正在努力寻找效果确切、不含血清的成熟培养液。研究显示，合成培养液(如 SOFM、KSOM)中用BSA或 PVA及氨基酸代替血清作成熟培养液，可以使卵母细胞成熟，并能

进行受精后的发育，用复合输卵管合成液(supplemental synthetic oviduct fluid medium，cSOFMaa)培养成熟的牛卵母细胞，发育到囊胚的能力与TCM199 +NCS培养成熟的卵母细胞相同，氨基酸的添加可以提高成熟卵母细胞的发育能力，增加囊胚中的细胞数量，提高卵母细胞中母型 mRNAs 的转录水平(Watson，2000)。Gardner等设计出了一种基础成熟培养液(G-Mat)，用重组蛋白以及透明质酸代替血清，培养牛卵母细胞，取得了理想的效果，不仅囊胚的发育率高于 TCM199+10%FCS培养成熟的卵母细胞，而且囊胚中的细胞数目也显著增加(Gard2ner，2001)。合成成熟培养液中能量供应物的选择是其中的一个重要方面，猴卵母细胞成熟液中，葡萄糖是必须的，而且足以满足成熟过程中的能量需求，加入丙酮酸后会抑制葡萄糖对胞质成熟及卵丘细胞扩散的促进作用(Zheng，2001)。

许多研究表明，体外受精囊胚期前的胚胎代谢活动主要是由母源性基因及其产物，如mRNA、rRNA、蛋白质等所调控的，因此卵母细胞成熟情况是决定受精率及其囊胚发育率高低的关键。影响卵母细胞成熟的因素很多，主要包括卵泡大小、卵巢的发育阶段、培养基、激素以及生长因子等。据报道，牛卵母细胞体外成熟时间为培养后18～24 h，但受精率，受精胚发育率也有差异。在金黄仓鼠和大鼠，曾有人研究认为FSH对核成熟有抑制作用，而且对减数分裂纺缍体有损害，促性腺激素对卵母细胞的有害作用可被添加血清所抵消。张涌和刘泽隆等研究了不同浓度的血清，FSH，LH，E2及培养时间对卵母细胞成熟的影响，并认为TCM199+10%-15%奶牛卵泡液是卵母细胞成熟的理想培养系统。

1.2卵母细胞的来源

卵母细胞是体外胚胎操作的基础。来源主要有三个途径:一是利用超排技术，从输卵管获得成熟卵母细胞，适用于小型动物，对牛等大型动物而言，适用价值不大，二是利用腹腔镜进行活体采卵，可充分利用优良母牛的卵母细胞；三是采自屠宰场的遗弃牛卵巢。目前，家畜体外受精研究中使用最多的是屠宰场遗弃卵巢，它成本低、取材方便，能满足胚胎体外生产的大批量需要，但若要用于生产性移。

1.2.1奶牛卵母细胞的成熟

卵丘-卵母细胞复合体(COC)一个充分生长的牛卵母细胞被一层非细胞基质即透明带包围着，透明带又被几层卵泡细胞如放射冠细胞和卵丘细胞包围着。这三部分构成了卵丘-卵母细胞复合体。卵母细胞完成生长并具有了减数分裂的能力时，就进入减数分裂前期I的双线期即核成熟阶段，这时核物质被包裹起来，形成种核泡(GV)。种核泡阶段的卵母细胞质中的细胞器被收拢在一起分布于卵母细胞周围，其余胞质由许多散在的脂质滴和胞质泡组成。处于成熟阶段的卵母细胞，卵丘细胞通过大量充满肌纤维蛋白的带状结构紧密包裹着透明带，保持卵母细胞和卵丘细胞之间通过缝隙联合(GapeJunction)进行离子交换和一些小的代谢物质的交换。

卵母细胞在体内一直处于种核泡阶段，直至排卵前在促黄体素(LH)分泌高峰的刺激下才达到最后成熟。这一过程是由卵丘细胞、细胞核和胞质之间的协调作用所完成。经过一次LH高峰后，卵丘细胞、透明带、卵质及细胞核之间将发生一系列连续性的结构和分子方面的变化，卵母细胞完成核成熟(MetⅡ)和胞质成熟，卵丘细胞覆盖范围扩大，引起排卵，这时的卵母细胞才具备受精能力。

从卵巢中采集到的卵母细胞，外面有多层卵丘细胞包围，故称为卵丘-卵母细胞复合体，此时的卵母细胞不能用于受精。正常在体内成熟的卵母细胞是在LH分泌高峰的刺激下才完成的。卵丘细胞，透明带，卵质和细胞核发生一系列连续性的结构和分子方面的变化，完成核成熟和胞质成熟，卵泡细胞扩散，卵泡破裂引起排卵，这时的卵母细胞才具备受精和发育能力。牛卵母细胞体外成熟，就是要模拟体内成熟环境，使从卵巢采集的未成熟卵母细胞达到最后成熟。

1.2.2牛卵母细胞体外成熟的方法

直径大于110um的卵母细胞能够完成减数分裂和卵裂。体外成熟用的卵母细胞一般从 2-7mm的卵泡上收集。谭世俭的研究表明，小于2mm的牛卵泡中的卵母细胞体外囊胚发育率最低，而6-8mm的卵泡中的卵母细胞体外囊胚发育率高。Pavlok 等（1992）研究结果表明，从小于或等于2mm的卵泡收集的卵母细胞体外成熟和受精后胚胎不能发育至8细胞阶段。而应收集卵质均匀、卵丘细胞致密，多层的卵母细胞。COCs的初期质量是决定卵母细胞成熟能力和以后受精能力的重要因素。透射电镜观察到，劣质卵母细胞易发生不正常成熟。胞质不正常或不完整的卵母细胞体外成熟和受精后的胚胎发育率低。因此，为确保牛体外胚胎生产的成功，选择适当大小卵泡和质量合格的COCs是必要的。

卵母细胞的体外常规成熟应在组织培养液和良好的气相条件下进行，同时添加血清或血清和1种或几种激素的混合物。使用发情母牛血清可避免外源激素的增加，添加排卵前后（例如LH高峰后）牛卵泡液可获得同样效果。添加含LH（50ug/mL）和处于发情周期第20天的母牛血清的培养液可提高卵母细胞的成熟质量。绝大多数情况下培养液中添加犊牛血清（FCS）与 LH，FSH和雌二醇E2）结合使用。培养液中加入OCS比FCS和其他激素更能提高成熟卵母细胞的受精力和卵裂率。

1.3卵母细胞的成熟判断

卵母细胞在体内生长期间，各种类型的RNAs合成旺盛，并进行蛋白质积累。在生长期后或体外培养，RNA的合成维持在较低水平，显著的蛋白质合成发生在生发泡破裂前后(Kastovp等1990)。这些新合成的蛋白质不仅与卵母细胞自身成熟有关（激活成熟因子，MPF），而且与卵母细胞受精后的发育有关。卵母细胞受精后3个细胞周期的细胞合成代谢是由贮存在细胞质中的mRNA和rRNA完成的，故细胞质成熟的质量如何，直接影响到早期胚胎发育的能力。卵母细胞成熟后期细胞器完成重新组装，由高尔基复合体分泌形成皮质颗粒，并逐渐向质膜下迁移，高尔基体本身消失，线粒体分布在核周围。胞质内有PAS阳性的囊泡和脂滴。

卵母细胞体外成熟一般是以卵丘细胞扩张、第一极体排出作为形态上的标志。减数分裂的完成仅仅是卵母细胞成熟的一个方面，卵内细胞学变化及蛋白质和RNA的合成与储备是正常受精和卵裂的先决条件。因此，卵母细胞成熟的判定应为卵受精后能否正常卵裂、发育和产仔。总之，要提高体外成熟卵母细胞的质量和数量，主要应解决以下问题： 第一，更好地选择能维持胚胎发育的卵母细胞进行成熟培养；第二，了解控制卵母细胞成熟的机理；第三，探求用以培养出腔前卵泡卵母细胞成熟的培养体系，以扩大卵母细胞的来源。材料及方法

2.1 卵巢卵母细胞的采集

将采集的卵巢置于37 ℃含双抗的灭菌生理盐水的保温瓶中，6 h 内运回实验室。用等温的生理盐水清洗卵巢，用10 mL 注射器吸取卵巢表面 2-5 mm 大小的卵泡，卵泡液收集于培养皿中，待用。

2.2成熟液的配置

成熟液(1)：M199；成熟液(2):M199+PMSG(25μg/ mL)；成熟液(3)：M199+PMSG(50μg/ ml)；成熟液(4):M199+PMSG(75ug/ ml)。收集可用于成熟培养的卵丘-卵母细胞复合体(Cumulus Oocyte Complexes，COCs)，将收集的COCs分别用4种不同的成熟液清洗三遍，然后置于含成熟培养液的培养皿中，在38.5℃,5% CO2和饱和湿度的CO2培养箱中培养。

2.3成熟卵的检查

将成熟培养后22h 的 COCs用100μL的微量移液器反复吹吸，去掉成熟卵母细胞表面的卵丘细胞，用M199 洗涤三次，以排出第一极体为成熟标准，然后于显微镜下检查成熟率。结果与分析

表 1不同浓度PMSG对牛卵母细胞体外成熟的影响

培养液

M199+10%FBS

M199+PMSG(25ug/ml)

M199+PMSG(50ug/ml)

M199+PMSG(75ug/ml)卵丘-卵母细胞总数 30 30 30 30 成熟卵母细胞总数 11 21 24 20 成熟率（%）36.770.080.066.7bcba 注：上标a,b,c值表示差异显著（p﹤0.05）。

由上表可见，培养液中无PMSG组成熟率最低36.7%，当成熟液中添加了25μg/ mL 的 PMSG 后，卵母细胞成熟率迅速提高至70.0%，随成熟培养液中 PMSG浓度进一步增加，卵母细胞的成熟率也相应提高，其中50μg/ mL 组卵母细胞的成熟率最高，为80.0%，75μg/ mL 组成熟率略有下降为66.7%，但下降不明显。由表1知，卵母细胞发育早期，PMSG具有促进卵母细胞增殖和分化的能力，成熟液中PMSG 的浓度决定了卵母细胞成熟率。但 PMSG 浓度的大小与卵母细胞激活后卵裂率无关，这可能是与因为在激活过程中去除了颗粒细胞有关。讨论

动物卵泡的发育依赖于 PMSG 的供给。在卵泡的发育过程中，特别是对于初始阶段以后直径为6mm马的有腔卵泡，PMSG起着至关重要的作用。许多学者研究认为，在基础培养基中添加LH能提高卵母细胞的成熟率、受精率及胚胎发育率。Saeki等在牛的研究结果中也表明，LH能显著提高体外成熟卵母细胞的受精能力，而且旭日干用hCG代替LH也取得了类似的结果。FSH也能显著提高体外成熟卵母细胞的体外受精能力及早期胚胎的发育能力，并且常和LH一同使用FSH的作用机理，一般认为可能与诱导卵丘扩散，促进卵母细胞质成熟有关。本试验证实了50μg/ ml PMSG 对于奶牛卵母细胞体外成熟培养发挥着关键的作用。

5结论

培养液中添加浓度为50μg/ mL的 PMSG 对奶牛卵母细胞的成熟率效果最好。

致谢

首先衷心感谢塔里木大学动物科学学院的老师们在我的学习及生活中给予的帮助。在大学五年期间，各任课老师在学习上给予了很大的帮助，如果不是他们的悉心教导，我就不会取得优异的成绩，在此向各位曾经传授我知识的老师们表示感谢。

至此论文完成之际，我衷心的感谢我的指导老师曾维斌，感谢曾维斌老师在学习、工作和生活中给予的亲切关怀和对课题的悉心指导以及对论文进行了细心的审阅，从在整个论文的写作与修改都凝聚着曾老师的心血。老师严谨的科学态度，渊博的专业知识深深的影响了我，让我知道了无论做什么事情都要保持认真，从事科学学研究就要有谨慎的科学的态度平易近人的善品格我在做人做事等诸多方面获益匪浅。仅此，谨向曾维斌老师致以衷心的感谢。

再次感谢动物科学学院的各位领导和老师四年以来对我的培养和教诲，感谢所有关心、支持、帮助我完成学业的领导、老师、同学和朋友们。愿他们工作顺利，身体健康。

参 考 文 献

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