分子生物学实验2 大肠杆菌感受态细胞的制备_细胞与分子生物学实验

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实验 大肠杆菌感受态细胞的制备

实验原理：转化是将异源DNA分子引入另一细胞系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种手段。受体细胞一般是限制-修饰系统缺陷的变异株，经过CaCl2等化学试剂的处理后，细胞膜的通透性发生变化，成为能容许带有外源DNA的载体分子通过的感受态细胞。经过转化的细胞在选择性培养基上，可以筛选出转化体，即带有外源DNA分子的受体细胞。

实验目的：学习氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞过程。

实验内容：JM109感受态细胞的制备、一、实验材料和试剂

大肠杆菌JM109或DH5α，LB固体/液体培养基，0.1mol/LCaCl2溶液。

二、主要设备

台式高速离心机，超净工作台，低温冰箱，恒温水浴锅，制冰机，分光光度计，微量移液器、恒温摇床，等。

三 实验方法

1.受体菌的培养

从于37℃培养16-20小时的新鲜LB平板上挑取新活化单菌落，接种于3~5ml LB液体培养基中，37℃下振荡培养（300rpm）12小时左右，直至对数生长后期。将该菌悬液以1：100~1：50（V：V）的比例接种于100ml LB液体培养基，37℃下振荡培养2~3小时至OD600=0.35～0.5左右。

2.感受态细胞的制备

（1）在无菌条件下，将培养液转入预冷的1.5ml离心管中，冰上放置20min，使其停止生长。

（2）4℃下，4000rpm离心5min，弃去上清。

（3）加入0.75ml预冷的0.1mol/L CaCl2溶液悬浮细胞，冰上放置30分钟，4℃下4000离心5min。

（4）弃去上清，加入0.2ml预冷的0.1mol/L CaCl2溶液悬浮细胞，贮存于4℃备用。或贮存于-70℃（加10-30%的甘油），可保存半年。

四.注意事项：

1、整个实验都应在无菌的条件下操作。

2、整个操作均在冰上进行，不能离开冰浴，否则细胞转化率会降低。