举例说明免疫学常用的分子生物学方法_免疫学常用实验方法

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作业：举例说明免疫学常用的分子生物学方法

下面我主要浅谈一下免疫学中细胞因子检测技术常用的分子生物学方法 机体的免疫细胞（如淋巴细胞、单核—巨噬细胞）及非免疫细胞能产生不同种类的细胞因子，它们在免疫应答中起调控作用。细胞因子检测是判断机体免疫功能的重要指标，对某些疾病的诊断、病程观察、预后判断等是十分必要的。目前常用的检测细胞因子的方法主要有生物学方法、免疫学方法和分子生物学方法。分子生物学测定法：应用细胞因子核酸探针（cDNA或基因组等探针）检测，通过分子杂交技术检测细胞内细胞因子mRNA的表达，可用斑点杂交、Northern印迹杂交及原位杂交等方法检测。

（1）细胞因子的DNA检测

主要用于检测细胞因子的基因有无缺失、放大、突变及某些细胞因子的多态形分析。常用的方法有Southern印记、PCR、原位杂交及原位PCR等。

1）Southern印记杂交：Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量。

2）PCR：聚合酶链式反应，简称PCR。聚合酶链式反应(PCR)是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法,由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期,循环进行,使目的DNA得以迅速扩增,具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。它不仅可用于基因分离、克隆和核酸序列分析等基础研究,还可用于疾病的诊断或任何有DNA,RNA的地方．聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction，简称PCR）又称无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增技术。

3）原位杂交与原位PCR：

原位杂交技术的基本原理是利用核酸分子单链之间有互补的碱基序列，将有放射性或非放射性的外源核酸(即探针)与组织、细胞或染色体上待测DNA或RNA互补配对，结合成专一的核酸杂交分子，经一定的检测手段将待测核酸在组织、细胞或染色体上的位置显示出来。为显示特定的核酸序列必须具备3个重要条件：组织、细胞或染色体的固定、具有能与特定片段互补的核苷酸序列(即探针)、有与探针结合的标记物。

原位PCR：是一种把原位杂交的细胞定位技术与PCR的高灵敏度相结合的技术，即通过PCR技术以DNA为起始物，对靶序列在染色体上或组织细胞内进行原位扩增，使其拷贝数增加，然后通过原位杂交方法检测，从而对靶核酸进行定量定位分析。

(2)细胞因子mRNA表达的检测 常用的方法有Northern印记，RT-PCR，原位杂交及原位PCR等。原位杂交是在组织细胞切片上用标记的核酸探针检测胞质内的特异mRNA；而检测细胞内低拷贝mRNA的方法则用原位RT-PCR。

1）Northern印记杂交：Northern blot被用于研究特定类别的RNA分子的表达模式(丰度和大小)，是一种将RNA从琼脂糖凝胶中转印到硝酸纤维素膜上的方法。RNA印迹技术正好与DNA相对应，故被称为Northern印迹杂交。Northern印迹杂交的RNA吸印与Southem印迹杂交的DNA吸印方法类似，只是在进样前用甲基氢氧化银、乙二醛或甲醛使RNA变性，而不用NaOH，因为它会水解RNA的2’一羟基基团。RNA变性后有利于在转印过程中与硝酸纤维素膜结合，它同样可在高盐中进行转印，但在烘烤前与膜结合得并不牢固，所以在转印后用低盐缓冲液洗脱，否则RNA会被洗脱。在胶中不能加EB，因为它会影响RNA与硝酸纤维素膜的结合。为测定片段大小，可在同一块胶上加分子量标记物一同电泳，之后将标记物切下、上色、照相，样品胶则进行Northern转印。标记物胶上色的方法是在暗室中将其浸在含5ug／mL EB的0．1mol／L醋酸铵中10rain，光在水中就可脱色，在紫外光下用一次成像相机拍照时，上色的RNA胶要尽可能少接触紫外光。若接触太多或在白炽灯下暴露过久，会使RNA信号降低。琼脂糖凝胶中分离功能完整的mRNA时，甲基氢氧化银是一种强力、可逆变性剂，但有毒，因而许多人喜用甲醛作为变性剂。所有操作均应避免RNase的污染。

2)RT-PCR： RT-PCR 为反转录RCR（reverse transcription PCR）和实时PCR（real time PCR）共同的缩写。逆转录PCR，或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR, RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。RT-PCR广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。

3)原位杂交与原位RT-PCR：

原位RT-PCR：将组织样品经过固定液的固定，各种酶的处理，保留样品内的RNA，经过反转录，将样品置于常规PCR仪中进行反应，不同的是所用的特异性引物在5’端带有荧光基团，反应完毕后，展片于载玻片上，在激光共聚焦显微镜下观察。可以用于某个基因在细胞内定位表达的观察。