HPLC分离样品样品前处理方法_hplc样品前处理

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HPLC分离样品样品前处理方法

因为需要在仪器、柱子、溶剂和人力等方面做很大的投入，HPLC分离是一项成本很高的分离技术。而样品前处理结果的好坏对分离过程有非常明显的影响，有时会直接关系到分离的成败；如果能遵循适当的原则，做好样品的前处理，往往既提高了分离的成功率和效率，也大大降低了成本。目前分离成本是按进样针数分摊到每个项目组的，所以合成同事送分离样品前处理的好坏直接关系到所属项目的成本。样品前处理的技术比较复杂，并且跟合成反应的关联非常紧密，下面的方法是分离组根据经验总结出来的，并不完全，也希望合成同事提供更多的建议。另外，考虑到目标组分含量过低的样品会大量增加分离的难度和成本，分离组以后原则上不再接收含量低于10%的样品。

以反应中的添加剂，催化剂来分类：反应中使用高反应活性的物质，如三氯氧磷，二氯亚砜，NaH，LiAlH4等，反应后一定要淬灭。这一点合成同事都是了解的。但是后面的一点容易被忽视，就是要做好中和。比如三氯氧磷用水淬灭后产生磷酸和盐酸，要用弱碱中和至近中性。（近中性只是一个粗略的概念，如果可以知道样品用什么体系分离合适，最好能将样品溶液的pH调整为与该分离体系的流动相pH一致，酸性流动相pH～2,中性pH=6.8~7.5,碱性pH～10）,否则对制备柱会造成损坏.有些物质反应活性虽然不是很强，如多聚甲醛，但如果不淬灭，在样品溶液中，可能会继续反应，导致目标物纯度发生变化。曾经有一个样品，使用多聚甲醛，还原胺化反应实现N甲基化。本来粗品纯度很好，但是在分离过程中发现目标物纯度越来越低，原来样品结构中还有一个反应活性较弱的N，由于多聚甲醛未淬灭，这个反应活性较弱的N原子也被甲酰化，导致目标物纯度降低，这个样品分离失败。所以，反应后淬灭，中和是样品送分离前的必修课，不可偷懒。如果不按照此原则操作，样品送到分离组导致样品分离失败，或者严重的导致色谱柱损坏等，所增加的成本将会被分摊到相应的合成项目组。偶联反应类型中可能用到的金属催化剂，如Pd(dppf)Cl2, Pd-118, Pd2(dba)3等均相的Pd催化剂，CuI，Chan-Lam反应中会用到的Cu(Ac)2，其他还有TiCl4，钛酸四异丙酯，Fe(acac)2等。分别详细说明一下。

3.1 Pd催化剂如果是非均相的，则过滤即可去除。如果使用了Pd(PPh3)4，则由于该试剂不稳定，反应后会出现黑色Pd的沉淀，过滤也可以去除干净。如果使用过Pd(dffp)Cl2等均相的Pd催化剂，由于该试剂可以溶解于常用有机溶剂中，所以不能通过过滤去除。而如果不处理干净，Pd试剂在与流动相混合后析出，堵塞筛板，并与硅胶结合，导致反相色谱柱柱头变黑，柱压剧烈升高，色谱柱柱效严重下降，常常会出现白天摸好方法的样品，在晚上多次进样后峰型变差，纯度降低，不能满足交货要求，更严重的，色谱柱柱效的严重降低，会影响后续样品的分离，导致多个样品分离失败。所以，这类使用过Pd催化剂的样品如果不处理，不但样品不能顺利交货，还会导致色谱柱损坏，这样做绝对是得不偿失的。针对这种情况，分离组开发了用TMT溶液用来彻底沉淀Pd试剂的方法，去除Pd试剂对反相色谱柱的不利影响。方法非常简单，反应后加入TMT溶液，过夜放置，第二天过滤即可。

3.2 CuI，该试剂看起来好像是离子型化合物，很多同事认为该试剂易溶于水，用萃取的方法去除CuI。其实该试剂在DMSO，DMF中有很好的溶解度，而在甲醇，乙腈溶剂中溶解度非常有限，如果样品可以使用甲醇，乙腈溶解完全，就不要使用DMSO，DMF溶解。有的合成同事看到加入甲醇后还有物质没有溶解，就加入DMSO，认为把反应瓶中的所有固体都溶解了才能保证回收率，这是不对的。把对于分离不利的物质，或者杂质都溶解进来，增加了分离的难度，甚至会损坏色谱柱。对于自己做的反应，反应物的溶解性应该有一定了解，遇到不溶的物质，可以通过点板等手段分析一下。如果确实目标物只溶解于DMSO，DMF中，可以加入TMT-DMSO溶液，但是由于在DMSO中TMT-Cu的沉淀很细小，DMSO溶液粘度又很大，沉淀会悬浮在溶液中，直接过滤也阻力很大，难以操作。需要对样品先离心，而后将上清液过滤。

3.3 Cu(Ac)2是Chan-Lam反应中会用到的试剂，而且由于反应用量大，基本上1个当量，与上述Pd试剂催化剂用量不同，加入TMT沉淀后，会产生大量沉淀，直接过滤也是不现实的。必须先离心，再对上清液过滤。由于沉淀量比较大，可以通过增加溶液体积，让更多的目标物溶解在溶剂中来提高回收率。

3.4 TiCl4是一种强Lewis酸，加入水淬灭后会生成盐酸与Ti(OH)2，Ti(OH)2进而生成TiO2沉淀，可以通过过滤去除TiO2，为了让TiO2沉淀完全，建议加入弱碱性水，如稀氨水。钛酸四异丙酯，可以通过加入弱碱性水，生成TiO2的方法处理干净。如果含有该类试剂的样品做碱性分析或者碱性分离时，会在色谱柱的塞板上生成TiO2，导致色谱柱压力升高，柱效下降，导致样品分离失败，甚至色谱柱损坏。这个问题非常严重。分离组就有一根Waters Xbridge C18制备柱，价格约5万RMB，在做了一些含有TiCl4的样品后柱压升高，不能使用。后经过使用醋酸反冲的方法处理，柱压有所下降，但柱效已经严重下降，这是因为高柱压已经破坏了柱床的结构，造成不可逆损坏。对于含有这类试剂的样品，合成同事应该做好前处理工作，如果由于这类样品导致色谱柱损坏，合成项目组将会被分摊到相应的色谱柱费用。

3.5 Fe(acac)2也可以通过加入TMT沉淀，由于用量大，要离心，上清液过滤。缩合反应中的缩合剂。比如HOBT，EDCI这一对最常用的缩合剂。由于HOBT带有弱酸性，而EDCI反应后的氧化产物，ms174的物质为碱性，含有一个叔胺基团，当分离体系选择中性分离时，这两种物质都是出于极性最大的状态，易于通过分离去除干净。而产物为酰胺，在中性条件下保留最强，所以缩合反应的样品可以首选中性体系分离。5 反应中使用过三苯基膦。反应后会生成三苯氧磷。三苯氧磷常常会与目标物在分离时共流出，对目标物的顺利纯化造成困扰。其实完全可以通过一般目标物含有碱性N原子、可以在酸性条件下带上正电荷，而三苯氧磷为中性、不带电荷的差别，通过离子交换方法去除。详情请参见《药明康德化学通讯》第6卷第3期《离子交换分离模式在样品纯化中的应用》 类似的还有TBAF。TBAF是一个季铵盐，即便把溶液的pH调整为13，TBAF还是带正电荷的。如果样品中的N原子都是一些弱碱性N原子，在通过调整样品溶液pH，使样品溶液的pH约为目标物pKa+2，这样的条件下，目标物99%都处于不带电荷的状态，就可以通过阳离子交换树脂柱去除TBAF了。由于TBAF无紫外吸收，而且为强碱性季铵盐，如果使用碱性条件分离样品，TBAF会在色谱柱上严重拖尾，导致目标峰分离后仍混有TBAF，而且由于无紫外，分离时不易发现，只有做ms或者lcms检测才会发现。含有TBAF的样品只要按照上述的方法正确处理，先处理，再分离，就不会给样品的反相分离造成困扰，节省了时间和成本。溶解度差的样品。其实从样品的溶解度也可以初步判断样品用什么样的分离手段比较合适。比如二氯甲烷易溶的样品，应该首选TLC或者正相开放柱分离。如果二氯甲烷溶解度差，而甲醇溶解度较好的物质，可以考虑反相分离。反相分离时的两相分别是水和乙腈。一般甲醇，乙腈溶解度较好的样品（大于10mg/ml），直接用反相分离不会造成太大问题。而如果样品只能溶解在DMSO，DMF溶液中，加入甲醇，乙腈就会立即析出，这样的样品不能直接分离。需要针对对沉淀进行分析。曾经有一个样品，粗品lcms图谱显示纯度约为50%，但是制备HPLC进一针后只看到一个色谱峰，ms检测为其中的杂质，目标物的色谱峰找不到了。当尝试对样品的粗品再取样，用乙腈稀释，再分析一下粗品的情况时，发现加入乙腈后样品立即变浑浊。这样就可以解释为什么样品在制备HPLC上不出峰了，应该是目标物都析出在色谱柱前端，乙腈-水体系无法洗脱下来，所以只看到了杂质。将沉淀滤出来，再用DMSO溶解，分析结果显示纯度很好，不用再分离了。这个例子告诉我们，溶解是分离的前提，如果样品在水-乙腈体系中溶解度很差，直接进行反相分离就是不合适的。如果合成同事没有时间摸索重结晶的方法，则可以把样品的溶解度信息告诉分离人员，或者在DB中注明。对于这类溶解度差的样品，可能有时并不会像这个例子这样极端，而是部分被洗脱出来，但肯定会影响回收率。另外，很多含有金属离子（Cu2+, Sn4+等）的样品，除了会导致色谱柱严重损坏，还经常会在紫外检测池中析出，附着在紫外检测池内壁上，导致检测池透光率降低，表现在色谱图上就是样品的吸收降低了，严重的会导致后续样品峰吸收很低，甚至无法正常收集，样品就被浪费了。我们所使用的Gilson半制备型检测池价格约1万多RMB，有的用稀硝酸浸泡可以部分恢复，有的则没有效果，只能换新的。所以含有金属离子的样品务必要在送分离时跟分离人员交流清楚，建议在DB中注明反应类型，以及使用过哪些催化剂等信息，这些信息对于样品的顺利分离非常重要。9 样品前处理经验交流之离子交换SPE的使用

离子交换树脂的使用参考《药明康德化学通讯》第6卷第3期的一篇文章：离子交换分离模式在样品纯化中的应用。其思路类似于调节水层pH，进行的水层与有机层的萃取，可以初步纯化反应物。

具体操作很简单：一般我们反应后的样品都带有一些碱性基团，可以加入弱酸，调节反应物pH，使样品带正电荷。溶剂要选择水，甲醇，或者水-乙腈混合溶剂，即要选择质子型溶剂，在这样的溶剂中样品才能带正电荷。将阳离子交换树脂SPE小柱用甲醇润洗，上样，甲醇洗脱5个柱体积后，用10%氨水甲醇将目标物洗托下来。这样操作之后可以将那些不能带正电荷的物质除掉，降低后续分离的难度。离子交换树脂适用于极性大，使用硅胶柱会发生死吸附的样品。样品前处理之硅胶柱初步纯化：

对于一些极性较小的样品，适合先使用硅胶柱进行初步纯化，比如可以将反应溶剂旋干后，用正己烷-乙酸乙酯溶解，上样到预先装好的硅胶开放柱，或者使用Flash快速柱色谱装置，配合Flash硅胶柱，根据TLC情况，简单的选择几个梯度的流动相，比如正己烷-乙酸乙酯10：1，5：1，2：1，纯乙酸乙酯等，每个梯度洗托2-3个柱体积，分别点板，确定目标物所在馏分。这样也可以达到样品初步纯化的目的。避免将含量低于10%的样品简单的丢到分离组。除去样品中Pd的TMT溶液的配方如下：

TMT，又名三聚硫氰酸，cas号为：638-16-4,结构如下：

SHNNHSNSH

TMT可以沉淀Pd等金属催化剂的原理在于TMT的巯基，H2S可以与铅等金属生成沉淀，中国药典就使用这个方法检测铅。TMT含有三个巯基，原则上可以与三个金属原子结合，生成的复合物分子量较大，不溶于水，甲醇，乙腈，DMSO，DMF等溶剂，可以通过过滤去除样品中的Pd试剂。

TMT溶液的配方为100ml溶液中包含45ml乙醇，5ml氨水（TMT为酸性，氨水可以增加溶解度），50ml水。再加入360mgTMT和1.4g NaCl。加入NaCl的目的在于，TMT与Pd(dppf)Cl2等有机Pd催化剂生成的沉淀为胶体，如果没有盐的存在，不会凝聚为大的沉淀颗粒，滤膜过滤时可以通过滤膜。

使用方法为：100mg反应物的溶液，一般加入1ml上述TMT溶液即可。放置过夜，再使用针桶配合滤膜过滤。也可以加热，加速该反应的进行，我们尝试过50摄氏度2小时也可以沉淀完全。

360mg TMT-->45ml ethanol 5ml ammonia water

1.4g NaCl-->50ml water

目前总结的这些经验也并不是完善的，还可以随着我们接触到的反应类型，催化剂种类的增加而增补。总结下来就是这样几条：

1、反应后要淬灭，中和

2、要尽量除掉样品中含有金属离子的催化剂、盐等

3、在DB中要写明反应类型，使用过哪些催化剂，缩合剂等，样品的溶解性信息