彗星实验_彗星试验

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彗星实验

收集目标细胞：处死小鼠后，迅速分离肝脏，选取最左叶肝脏，在4℃放置2h的PBS溶液中多次清洗，直至看不到血液。将肝组织至于含有2 mL4℃PBS溶液的小烧杯中，用小剪刀剪碎（2-3 mm）。台盼蓝排斥法检测细胞活力，细胞存活率大于95%方可用于实验，调整细胞密度为5×105-106个/ml。此步在暗室中进行。

制片：取100 μL置于45℃预热的0.75% NMA滴加于载玻片一侧，迅速盖上盖玻片（24 mm×50 mm），注意不要产生气泡，至4 ℃凝固约20分钟后轻轻移去盖玻片。吸取10 μL待检测的细胞悬液与100 μL 37℃预热的0.75% LMA混匀，迅速将细胞混悬液滴加到第一层凝固的NMA上，再迅速盖上盖玻片使其均匀铺开，同样需避免起泡。将玻片至4℃凝固约30 min，操作注意避光，每只动物制作三张平行片。

裂解：轻轻移去盖玻片，将载玻片水平轻缓浸入4℃预冷的裂解液（pH= 10），于4℃避光放置1 h。

解旋：轻轻拿出载玻片，浸入PBS缓冲液5 min，用滤纸吸去多余水分后放入电泳槽。玻片并列放置，不留空隙。将新鲜配置的冰冷电泳缓冲应用液轻轻倒入电泳槽，使液面完全覆盖载玻片，放置20 min解旋。避光进行。

电泳：根据预实验，设置电泳仪25V、300 mA电泳20 min。避光进行。中和：切断电源，小心取出玻片，置染缸，中和缓冲液浸洗，3次×5 min/次。

脱水保存：从电泳仪中轻轻取出载玻片，浸入PBS缓冲液2次×5 min/次。吸干周围水分后放入乙醇脱水，约1 h后取出自然晾干保存。

染色：在玻片上滴加EB染色液50 μL（5 μg/mL）染色，盖上新盖玻片。用滤纸吸去多余染料，于2 h内使用荧光显微镜镜检。

镜检：EB染色后，未受损细胞在镜下表现为为圆形荧光核心，只有彗星头部，没有明显的尾。受损细胞则有彗星尾伸向正极，形成一个亮的头部和尾部，形似彗星。所有玻片在观察前均重新独立编码，以便于盲法阅片。荧光显微镜使用蓝光作为激发光，40倍物镜下采集图像，每个玻片计数50个细胞，每只动物共计数100个细胞。彗星图像使用CASP图像分析软件，检测指标为%Tail DNA（尾部DNA百分比）、尾长（tail length，TL）和Olive尾矩（Olive tail moment，OTM）。