分离流_场流分离

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在螺旋微通道中，惯性微流体的连续颗粒分离问题

在这项工作中，我们报道了一项简单的惯性微流体装置，它利用迪安夫妇的螺旋微通道中的惯性迁移原则，实现连续多粒子分离.由于曲线微通道几何原因，占据显著地位的惯性力（附加了迪恩旋转力）导致了微粒在靠近内微通道壁附近占据了一个单独的平衡位置.该颗粒平衡的位置依赖于惯性升力转换成迪恩曳力的比率。使用此概念，我们可以初次证明，（）用适当设计的出口系统可以收集单个粒子流。为了证明这一理论，一个固定的宽度为500mm和高度为130mm的5环阿基米德螺旋微通道被同时且连续的用于分离10mm，15mm，和20mm的聚苯乙烯粒子。该设备表现出90％的分离效率。分离成神经细胞瘤和神经胶质瘤细胞时能够达到80％的效率并且有着相对高的存活率，这都证明了该装置的通用性。每分钟一百万个细胞的完成量比报道的应用其他微型排序方法的排序率要高出许多，同时，这一完成量也相当于商业宏观流动式细胞技术所获得的利率。被动的微射流方法所提供的简单平面结构和高流通量使这种方法在生物医学和环境应用领域中对LOC设备具有很大的吸引力。引言

在许多芯片实验室(LOC)系统中，对于生物医学和环境的应用领域来说，高通量微粒分离技术正在变得越来越不可或缺。而单单对于生物医学应用来说，在大多数发展完善的芯片实验室(LOC)系统中，微粒分离器被用于基于尺寸的分离和细胞的分类。在全血液中，人类的T淋巴细胞的高效分离对于艾滋病毒疾病的诊断和治疗是关键的一步。或者，神经母细胞瘤和神经胶质瘤细胞的分离也许可以在神经变性疾病和癌症的细胞替代疗法中存在潜在应用性。微粒子分离器的环境应用包括在水质分析中有害细菌或金属纳米粒子的提取。

在宏观尺度上，传统的基于尺寸的分离技术包括多孔膜滤池的使用。通过采用具有不同孔尺寸的膜，多组分粒子的渗透就可以实现。然而,在微尺度上,膜渗透技术有着各种缺点，其中就包括复杂的3-D结构的制造限制了孔径大小以及膜的堵塞所引起的问题。在微尺度方面，这些因素限制了这种技术的普及，也导致众多的少膜分离技术的发展。

在微尺度上，电泳和介电电泳已用于实现高分辨率的粒子分离。因为分离原理是基于大小的，所以两个或更多颗粒尺寸的分离，可以同时实现。但是，这些技术需要外部电源，并且由于在批处理模式下运行，所以无法处理大量样本。这导致了几个被动连续溢流分离技术的发展，如捏溢流分级，沉降，水动力色谱法和确定性的侧向位移。

两种或更多种粒子成分能够同时被动分离,这已经成功地证明了以微型捏流分离利用和确定的横向位移为基础的技术。在捏流分离中，有无粒子被引入微通道，流体的流动都包括收缩和扩大段。在收紧段，通过控制无粒子的流体流动速率，粒子沿着通道侧壁是一致的。当粒子从收缩段行进到扩大的微通道段时，小些的颗粒会受到指向的通道侧壁的力，大些的粒子会受到指向通道中心的力，这样就实现了分离。在确定性的横向位移中，微柱被适当地放置在微通道中，这样就会使粒子大于临界直径(w是两柱之间的距离），并且遵循一个确定的路径导致基于尺寸的多粒子流的形成。该方法被成功地用于证明有着0.8mm，0.9mm和1mm直径的微粒的高效分类。虽然这些技术操作是在连续模式下操作的，但是，在PFF中对狭窄通道几何形状的需要和在DLD中对障碍物存在的需要可能会导致通道堵塞和颗粒与颗粒间的相互作用。此外，所报道的生产量对细胞的分类和血细胞技数的应用是不足的。

最近据报道，基于粒子过滤技术的惯性迁移已经实现了高生产量的颗粒分离。在惯性力的作用下，中立的活跃粒子沿通道外围从微通道迁移位置流动到稳定平衡位置。帝卡罗表明，通过采用曲线通道，狄恩涡流可用于将平衡位置的数目减少到一个。这一单个粒子流稍后可以通过利用分叉口被提取出来。使用这种技术可以实现快速微粒过滤。例如，最近通过确保较小粒子的运动仅受迪安力的影响，较大粒子的迁移运动仅受惯性升力的影响，我们论证了两粒子混合h后的完全分离（7.32毫米和1.9毫米直径）。

在我们先前的工作中，通过利用迪安阻力和惯性升力的影响，我们提出了一种构思以实现两种不同粒子尺寸的完全分离。在内微通道壁处，并且在惯性升力和迪恩力的合力作用下，较大粒子能够处于平衡状态。然而，惯性升力并没有影响较小的粒子的迁移，这些粒子由于迪安阻力的作用转换到了微通道外壁。由于粒子的分离并不依赖于两种力量的比例，所以该构思的一个主要限制是无论出口数量是多少都不能分离比两粒子混合更多的粒子混合。

在这篇文章中，我们第一次证明了迪安同惯性迁移一起同时去分离多粒子混合的用处。在一个曲线微通道中，迪安阻力和惯性升力的结合导致在内微通道壁处的粒子平衡。粒子所处于平衡的位置依赖于这两种力的比例。在这一工作中，我们形成了一种构思，这种构思依赖于两种力的比例，并且利用粒子大小以形成隔离，同时这一构思聚集了粒子流，这些粒子流通过采用合适的输出系统都可以被提取出来。虽然在此提出的这一构思与此前提出的螺旋分离器的构思很相似，但是，实现分离的工作原理是不同的，并且，这也是第一次利用惯性微流体证明多粒子分离。此外，在工作中提出的这一系统制造起来简单、容易。并且在一个宽阔的动态范围内能够保持一个高的产量去分离粒子。所提出的原理还被用于证明在SH-SY5Y成神经细胞瘤细胞和C6胶质瘤细胞之间的基于尺寸的细胞分离。

2.设计原理

在我们最近的工作中，我们发现，在迪安阻力和惯性升力的合力的作用下，粒子在螺旋微通道中的流动轨迹是一个长方形的横截面的形状。这些力的大小和方向取决于粒子穿过微通道横截面时的大小和位置。粒子（）（在这里ap是粒子直径，Dh是微通道水力直径），惯性升力控制并负责微通道内粒子的平衡。在此，我们论证了在该位置不同尺寸粒子的平衡是依赖于惯性升力和迪安阻力的比率的，这一比率是随着粒子的第三功率的变化而变化的。通过调整流动参数，分离应用程序可以产生单个粒子流，如图所示.1.在一个平面泊肃叶流动中，速度剖面图的抛物线特性导致了剪切梯度诱导了惯性升力，导致惯性升力促使悬浮微粒远离微通道中心朝向通道壁而去。随着粒子向通道壁靠拢，由于微通道壁的存在妨碍了粒子周围的旋转轨迹，使粒子上的惯性升力垂直地离开了微通道壁。这些相反的垂直作用力将净升力作用于平衡粒子上，使它们进入微通道周围的集中流。塞格雷和西尔伯贝格第一个报道这种作用的人，他们论证了中性悬浮粒子的均匀分布，在半径为R的圆形通道的通道中心形成了一个窄频带

图一，(a)螺旋微粒分离器的原理图。在FD和FL的影响下，随机分布的粒子在沿着螺旋微通道的内壁（IW）上，平衡在不同的平衡位置。通过打开螺旋通道使粒子流进入更宽阔的笔直通道中，并且，在提取单个粒子流之前，运用多出口的设计方案，单个粒子流之间的分离被增强了。(b)微通道横截面图显示了FL和FD对粒子的影响。两种力之间的比率（FL/FD）是决定给定尺寸（直径）的粒子的平衡位置的决定因素。

莱德表示，在正方形截面通道中，粒子平衡的最优位置是AP/DH=0.1。在我们之前的工作中，在限定Re的范围下，我们发现了在正方形和矩形微通道中粒子流动的平衡位置。在平面泊肃叶流动中，作用在悬浮粒子上的净升力是由下式给出的：

其中，是流体介质的密度，G是流体

速率，是由

GUmaxDh给出的，Umax是流体的最大速度CL是升力系数。这一系数是粒子在穿过通道横截面和雷诺数（Re）时粒子位置的作用结果。在距离通道壁0.2Dh处，并且在再次回落至零值之前，升力系数和之后的升力的大小都从通道中心处的的零值增加到了最大值，借以平衡粒子。除此之外，升力系数的改变表明了指向通道壁的升力的统治地位。

螺旋微通道的曲线几何引入沿径向向外的离心加速度分量，这导致了两个对称的反向旋转涡流的形成,这种旋转涡流被称为迪恩涡流。这些迪恩涡流的大小可通过无量纲数来确定，这些无量纲数是迪恩数（De），它由下式给出

（）对于一个连续微通道De=0，增加通道横截面（Dh）或者流动速率就增加了De，从而产生了更强的迪恩力。由于这些迪恩涡流，螺旋微通道中的悬浮粒子经历了一个横向曳力。粒子所受到的迪恩曳力可以通过斯托克斯曳力表现出来。

（）

在这里Udean是平均迪恩速率，Udean=（）

在长方形微通道的横截面上，粒子的平衡位置是独立于Dh的，同时也依赖于最短的通道尺寸。因此，评判粒子集中的标准是ap/H()0.07.我们用此结果来设计小展弦比螺旋微通道，从而在一个宽泛的粒子尺寸范围内去提高单个粒子流的分离率。在小展弦比螺旋微通道中，升力和迪恩曳力的比率对粒子尺寸和剪切率的调制的依赖性已经被利用来证明直径为10um、15um和20um的粒子的分离。在入口靠近内微通道壁处，当粒子流向下游流动时，占主导地位的惯性升力是与随机分布的粒子对应的。另一方面，依靠粒子的尺寸，有重要作用的迪恩曳力将这些集中的粒子流移动到更加远离通道壁的地方。这就导致了三种不同的粒子流的演变，并且，通过设计合适的出口，这些粒子流是可以被独立提取出来的。

3.实验方法

微通道是应用标准的软光刻的方法，由聚二甲基硅氧烷制造的。简短地说，负硅主是通过模仿所需高度的SU-8光阻材料制造的，同时这些光阻材料是用传统的光刻工艺制成的。随后，PDMS聚合物以十比一的比率与固化剂混合，随后将混合物浇注到所制造的硅原型上以形成所述装置的一个复制品。随着固化剂在加热板上以80摄氏度的温度加热2小时后，PDMS模具被逐渐剥离并且输入和输出端口被去芯，用14号注射器的针头。将PDMS模具结合到1mm厚的显微镜载玻片上，用电晕处理的棒完成通道。

在测试之前，从Bangs实验室购买的用荧光标记的聚苯乙烯粒已经稀释在了去离子水中。注射泵用来驱动已经充满了粒子溶液的注射器。去评估微通道内的粒子流的位置，微通道的高速图像被用一个倒置的，装备12位的CCD相机的荧光显微镜捕获了。使用图像软件，通过覆盖一叠300个图像，Z堆叠的合成图像将会被生成。在复合图像中，粒子流的位置是通过分析在整个通道宽度下灰色刻度线的扫描情况而确定的。

为了证明粒子混合物的分离，包含有直径为10mm，15mm，20mm的聚苯乙烯粒子（这三种直径的粒子分别标有DAPI, FITC, 和TRITC的荧光团）的溶液被应用。使用适当的滤波器立方体对粒子流分别进行观察和捕获。各个图像被叠加以创建一个合成图像，以显示三个单独的聚焦粒子流的形成。

为了确定分离效率，会通过流式细胞术收集并分析每八个出口中的一个出口的粒子流，BD生物学流式细胞术被用于完成分析。个别粒子溶液被用作控制装置去描绘 FSC和SSC对立时所形成的门。被收集的样本在之后被贯穿流式细胞分析仪以确定在全部八个出口中每三个粒子的数量。

为了证明细胞分离，SH-SY5Y 成神经细胞瘤细胞

结果与讨论

所制造的该设备包括五个环形阿基米德螺旋微通道，该通道有两个入口和八个一样的出口（如图二）。螺旋设计具有1厘米弯曲的初始半径，并且每一个螺旋圆环的间距都是固定的500mm。微通道的宽度固定在500mm，但是高度是在90mm和140mm之间变化的。在出口处，500毫米宽的通道打开到1毫米宽的分割段，在分成八个100mm宽的出口之前，以增加两个粒子流之间的间距（如图2（b））。

在这一工作中，我们依靠螺旋微通道中FL和FD的比例，利用粒子尺寸去分离直径为10mm，15mm，20mm的粒子。在测试粒子混合物前，粒子需要在不同高度和De的通道中分别被测量。对于每个通道的高度,通过增加流动速度，也会被增加，直到在出口处形成单一集中粒子流。增加流动速率更远的影响是导致聚焦的粒子流远离通道内壁朝着通道中心迁移。随着溢流速率进一步增长，迪恩力开始主导惯性升力，从而导致粒子流的分散。相似的表现也被迪卡罗等人注意到。粒子流的平衡位置被记录为De的函数。在被要求证明多粒子分离时，这些结果被用于选择最佳通道高度和溢流速率。

图3示出的合成图像表明，在不同高度的微通道中，直径为10毫米的粒子流的位置（x），为De的函数。直径为10毫米的粒子的悬浮液被引入两个入口并且所有图像刚好在所述出口500mm处被捕获到。对于一个给定的通道高度,随着De的增加，集中粒子流越来越多地离开通道壁，这表明迪恩力的主导地位。虽然增加溢流速度相比迪恩拖力更能产生较大的升力，但是粒子流远离通道壁的运动可以这样被解释：随着流体溢流速度的升高，惯性升力率是降低的。因此，净升力是随着溢流速度的增加而减少的并且粒子流远离通道壁。增加通道的高度也会造成集中粒子流进一步远离通道内壁，其可以通过以下事实来解释，对于给定的溢流速度Uf，迪恩曳力随着通道高度的增加而增大，而惯性升力随着通道高度的增加而减少。因此，该粒子流的位置可通过增加De或增加通道高度来改变。

图4（a）画出当作为De的函数时，在不同高度的微通道中，粒子流的位置与通道宽度相关。对于一个在90mm高的通道中的直径为10mm的粒子来说，在线性上升前，粒子流距离通道壁的距离保持恒定不变:De=8.8,作用在粒子上的惯性升力在低于De=8.8时是较大的，并且随后随着流体速度的增加，粒子流是不受影响的。然而，超过一个临界的De（流速）时，FD增加至和FL相同的顺序，并且随后粒子流的位置随着流动速率线性变化，表明了迪恩力的主导地位。增加微通道高度降低了De的临界值所需的粒子流的迁移，如图4（a）中所示，随着通道高度的增长迪恩力也越来越大。因此，在130mm和140mm高的通道的情况下，对于所有实验中的流动状况，粒子流位置都是变化的。

对于较大的，直径为15mm的粒子，在90mm和110mm的微通道情况下，更高的AP/ H比值产生了一个较大的提升力并且因此随着增加De，粒子流位置仍然不变。然而，与直径为10mm的粒子类似，增加通道高度导致了较低的P / E=0.1比值并且因此粒子流的位置被迪恩力强烈影响。同样地，直径为20mm的粒子得到较高的ap/H比值，导致在每个通道高度中作用于粒子上的FL需要被考虑。因此，对于直径为20mm的粒子来说，在所有绘图中，一块显著地扁平区域被观察到。在较大粒子的情况下升力支配地位的增加主要是由于对粒径上的惯性升力的强依赖性。因此，在这个90毫米的通道中，对于已经试验过的几乎所有的粒子流来说，直径为20mm的粒子流的位置是恒定不变的。

这些个别粒子试验结果表明，可以在不同的高度和一系列溢流条件下的微通道中实现三个粒子尺寸之间的完全分离。这样，在下一组实验中，我们就可以测试直径分别为10 mm, 15 mm和20 mm 的同类聚苯乙烯粒子混合物。粒子分离就是通过实验用直径分别为10 mm, 15 mm和20 mm的粒子（这些粒子分别用DAPI, FITC 和TRITC的荧光团标记）去观察。相应地，在通道出口处，过滤器立方体用于捕获每一个粒子流的图像。所捕获的图像进行再叠加以创建一个合成图像，这个合成图像即表示三种粒子流（图5）。为了提取的三个单独的粒子流，在De=14.4（流速为3 mL/min处),用130毫米高的螺旋微通道测试了该混合物。在到达开口之前，500毫米宽的通道打开到1mm宽的区域，在出口通道处，以利用层流剖面实现更好的分离。

入口和出口处的合成图像示于图。5。该图像清楚地表明，在所述微通道出口处，三种不同粒子流的形成。直径分别为10 mm, 15 mm和20 mm的粒子流在500mm宽的区域处的直径分别是180 mm, 120 mm, 和65 mm，这样，三种粒子流在出口处依次分为第一，第二，第三分别被收集。虽然通道高度决定是否

粒子集中到一个单一的粒子流中，但是，微通道宽度对粒子流之间的间隔有着极大的影响。因此，更宽的通道导致粒子流之间更大的间隔，这反过来又允许直径相差很小的粒子的分离。微通道宽度对这种分离技术的分辨能力是目前正在研究的。

从八个出口流出的粒子流通过流式细胞术被收集和分析以确定分离效率。图。6给出了流式细胞术的数据，表明在入口和出口处的粒子浓度。近98％的粒子在出口1，2和3被过滤出去，这表明了粒子是高度集中的。在三个粒子间可以观察到90％的分离率。通过用单分散粒子的混合物可以实现更高的分离率。虽然在这个工作中只证明了三种粒子的分离，但是运用更加宽阔的螺旋微通道去增加多个粒子流之间的间隔可以分离更多数目的粒子。

已发展成熟的高通量细胞分选技术的应用已经通过SH-SY5Y成神经细胞瘤和C6胶质瘤细胞的分离被证实。对于理解这些细胞在中枢神经系统（CNS）中独特功能方面，神经干细胞的完全分离有着至关重要的作用，并且在许多神经退行性疾病（例如帕金森氏，阿尔茨海默氏症，或多发性硬化）和癌症方面细胞替代疗法有着潜在的应用。

基于这些细胞的尺寸，在De=11.8处，将混合物通过一高120mm的微通道去从通道1收集直径（15mm）更大一些的细胞，从通道2收集直径（8mm）更小一些的细胞。图。7显示出了有着明亮视野并且荧光团的图像，图像说明在螺旋微通道的入口和最初的两出口处，较大的SH-SY5Y细胞（荧光团标记的）和较小的C6神经胶质瘤细胞（未标记）的分布。入口的溶液包括两个有着相等细胞浓度（500000？2个细胞/ mL）的细胞混合物。近90％的细胞被收集在出口1和2，表明了细胞高度的聚集。对于在出口1处两个较大的SH-SY5Y细胞和在出口2处较小的C6胶质瘤细胞，细胞分离率>80％，但是由于细胞尺寸的较大变化分离率被限制了。细胞分离时的一个潜在问题是高剪切力损坏细胞的可能性。将SH-SY5Y神经母细胞瘤和C6胶质瘤细胞放回培养基，24小时后恢复率>90%，这样，随着分离，细胞的生存能力就被证实了。

正如Pamme在最近的一篇论述中讨论讨论的那样，由于连续溢流分离技术能够实现高实验产量的能力，所以这种技术在微观方面越来越受欢迎。虽然最近已经报道了更高的生产量，但是许多这样的微流体系统的平均生产量是2,000 cells/min,例如，Fu等人在分离大肠杆菌细胞时，论证了1,200–7,200 cells/min的流通量，在用荧光激活的方式分类时，并且在微流通道中，没有标记荧光团的背景下，分离大肠杆菌细胞时显现出了绿色荧光蛋白。相似的生产量被Takagi等人用PFF方法所证明，他们从稀释的血液中分离出了红细胞。

由于作用在粒子上的惯性升力和迪恩曳力随着流速的增加而增加这一事实，所开发的螺旋式微粒分离器对实现高吞吐量的分离来说是理想的。对于测试过的流动速率来说，在我们的系统中实现了100万细胞分离率/分钟。这一生产量实质上是高于运用其他分离方法已经实现了的分离率。事实上，我们系统的生产量与运用商业的流式细胞术得到的分离率（这种技术具有240万细胞/分钟的最大生产量）是可以相比的。由于在我们的实验中只用了0.05％的容积率，所以通过简单地增加细胞容积率和流体流动速率，生产量甚至可以增加的更多，接近一个数量级。

5.总结

在这项工作中，在微粒子混合物同时被动分离方面，我们介绍了惯性微流控系统。在螺旋微通道中迪恩和惯性迁移的共同作用被开发出来，基于粒子的不同尺寸，在微通道中不同位置用于产生单个粒子的集中流。个别粒子被引导着进行试验去确定微通道高度和粒子流位置上的迪恩数作实验中。基于从各个粒子的实验中所得到的结果，利用130mm的螺旋通道去分离直径为10 mm, 15 mm, 和 20 mm的混合物。该装置的分离效率经计算为90％左右。该装置还用来显示具有高生存能力的神经细胞的高生产量分离，证明了在微尺寸细胞分类方面这项技术的应用性。被动分离原理和所描述的设计的平面性质将允许要求高生产量分离的现有的LOC系统进行简单的集成。