多糖的分离方法_多糖的提取分离方法

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多糖的分离方法

1分级沉淀法 糖类多数可溶于水，三糖以下尚可溶于乙醇。随着聚合度的增大，在乙醇中的溶解度逐步降低。根据这一性质，在糖的浓水溶液中，分次加入乙醇，使酵的浓度渐增，5％。10％，15％，20％…90％，分取各次析出的沉淀，在产量和醇浓度之间画出曲线，以此可以粗略地观察出糖的组分。若遇糖的衍生物，如甲醚、乙酸醑，其极性低于糖，可在有机溶剂中进行分级沉淀嘲1。多糖的分子量范围广，且有共沉淀现象。此法只能作粗略的分离用，需反复进行及综合使用别的方法才能达到糖的组分均一，物理常数恒定。2凝胶层析法 凝胶层析法(凝胶过滤法或分子筛层析法)主要利用具有三维网状结构的多孔性凝胶，其孔径大小决定于合成凝胶时所加交联剂的程度。当含有混合溶质的溶液流经适当的凝胶柱时，小分子易扩散入孔中，而大的则不易扩散，各溶质洗脱顺序随分子量由大及小，渐次流出。此法对于不同聚合度的糖类分离特别有效。方法快速、简单，条件温和。常用的有葡聚糖凝胶(sephadex G)、琼脂糖凝胶(SepharoseBio—gel A)、聚丙烯酰胺凝胶(Bio—gel P)等，常用的洗脱剂是各种浓度的盐溶液及缓冲液，但它们的离子强度最好不低于0．020。

3纤维素柱层析 纤维素对多糖的分离，是利用混合糖的溶液，流经预先以另一种溶剂(如乙醇)混悬的纤维素柱，多糖在此多孔支持介质上析出沉淀，再以递减醇浓度的稀醇逐步洗脱，溶出各种多糖。流出柱的先后顺序通常是水溶性大的先出柱，水溶性差的最后出柱，与分级沉淀法正好相反。此法较分级沉淀法为优，因为其接触面大。纤维素柱层析还可用丙酮、水饱和丁醇、异丙醇、水饱和甲乙酮等，或用丁醇：乙酸：水(9：2：1)、乙酸乙酯：乙酸：水(7：2：2)等系统。混合溶液可调节其组成比例。酸性多糖层析时，可利用其和季铵盐络合沉淀的反应，在洗脱液中加少量十六烷基吡啶氯化物，可使分离软骨硫酸盐等多糖获得好效果。

4离子交换纤维素层析 常用的阳离子交换纤维素有CM-cellulose、P—celhlose、SE—cellulose、SM-cellulose；阴离子交换纤维素有DEAE-cellulose、ECTE—cellulose、PAB-cellulose、TEAE-cellulose等。其中阳离子交换纤维素特别适用于分离酸性、中性多糖和粘多糖。交换剂对多糖的吸附力与多糖的结构有关，通常多糖分子中酸性基团增加则吸附力随之增加：对于线状分子，分子量大的较分子量小的易吸附；直链的较分枝的易吸附。在pH 6时酸性多糖可吸附于交换剂上，中性多糖则不能被吸附。当用硼砂将交换荆预处理后，则中性多糖也可以被吸附。分离酸性多糖所用的洗脱剂通常是pH相同离子强度不同的缓冲液，分离中性多糖的洗脱剂则是不同 浓度的硼砂溶液。

5季铵盐沉淀法 阳离子型清洁剂如十六烷基三甲铵盐(CTA盐)和十六烷基吡啶盐(CP盐)等和酸性多糖阴离子可以形成不溶于水的沉淀，使酸性多糖自水溶液中沉淀出来，中性多糖留存在母液中而分离。若再利用硼酸络合物。中性多糖亦可沉淀，或在高pH的条件下，增加中性醇羟基的解离度而使之沉淀。

6制各性区域电泳 分子大小、形状及所负电荷不同的多糖其在电场的作用下迁移速率是不同的，故可用电泳的方法将不同的多糖分开，电泳常用的载体是玻璃粉。具体的操作是用水将玻璃粉拌成胶状、装柱，用电泳缓冲液(如0．05mol／L硼砂水溶液，pH9．3)平衡3天，将多糖加于柱上端，接通电源，上端为正极(多糖的电泳方向是向负极的)，下端为负极，其单位厘米的电压为1．2-2V，电流30—35mA，电泳的时间为5 －12小时。电泳完毕后将玻璃粉载体推出柱外，分割后分别洗脱、检测。该方法分离效果较好，但只适合于实验室小规模使用，且电泳柱中必须有冷却夹层。

7金属离子沉淀法 铜盐沉淀多糖，可用CuCl2，CuSO4，Cu(OAc)：的溶液或是Fehling试剂、乙二胺铜试剂。通常需加过量的试剂用于沉淀，但Fehling试剂不可太多过量，因其有使多糖铜复合物沉淀重新溶解的危险。沉淀分解恢复可用酸的醇溶液或用螯合试剂。常用的铜盐分级沉淀法是Fehling试剂法和醋酸铜乙醇法。饱和Ba(OH)：溶液可使树胶类多糖沉淀，特别容易使B(1，4)一D一甘露聚糖沉淀而和木聚糖分离。另据报道，国外多采用LKB柱色谱，用比旋光度、示差折射及紫外检测多糖，各组分的峰位自动记录，分离效果高且方便。