Sysmex XE2100全自动血液分析仪自动幼稚粒细胞计数(IG)_血液细胞分析仪评价
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Sysmex Journal International Vol.12 No.2(2002)
Sysmex XE-2100全自动血液分析仪自动幼稚粒细胞计数(IG)与显微镜方法(NCCLS H20-A)的评估比较
Th WEILAND, H KALKMAN 和 H HEIHN 德国汉堡Barmbek General教学医院中心实验室，德国汉堡R-benkamp 148, D-22291 SYSMEX欧洲公司，德国Norderstedt
外周血中出现幼稚粒细胞是提示骨髓增生情况的潜在的重要信号。通常幼稚粒细胞的计数是通过显微镜检查，这是一项劳动强度大、费时的工作。Sysmex XE-2100全自动血液分析仪发布的新软件“XE Pro” 和 “IG Master”，正如制造商声称的使得早幼粒细胞、中幼粒细胞和晚幼粒细胞计数变得简单、快速、经济，并将这些细胞归并入“幼稚粒细胞计数”。
3这项实验通过246例常规的血标本（包括血液分析仪报告幼稚粒细胞超过0.1×10 /µL），对XE-2100“幼稚粒细胞计数”与显微镜方法（NCCLS H20-A）的一致性进行评估。线性回归和相关性分析显示两种方法有着很好的相关性(r=0.900)，其中部分婴幼儿的样本也同样显示良好的相关性(r=0.884)。在这项研究中幼稚粒细胞计数明显好于文献中报道的XE-2100以前的软件包的结果。杆状核不归入幼稚粒细胞计数。全自动血液分析仪实际计数值略高于显微镜方法。
在常规患者医护中进行全自动幼稚粒细胞计数的临床研究仍有必要，并以此建立能被临床接受的正常和异常的参考范围。
关键词：血液学，全自动血液分析仪、XE-2100、白细胞分类计数，幼稚粒细胞、方法学比较、NCCLS H20-A
和显微镜方法的敏感性的比较。
材料方法 介绍
外周血中出现幼稚粒细胞是显示骨髓增生情况的潜在的重要信号。除了诊断白血病的明显标志原始细胞外，骨髓的其他成熟阶段早幼粒细胞、中幼粒细胞和晚幼粒细胞也可以显示全身的炎症状况或者类白反应。通常幼稚粒细胞的计数是通过显微镜检查，这是一项劳动强度强、费时的工作。传统方法是对100个白细胞进行分类，这有着更多的缺陷：由于计数少部分细胞而使得准确性不高、重复性差、主观因素多。因此需要一种可靠的全自动的定量的幼稚粒细胞计数的方法。
Sysmex XE-2100全自动血液分析仪发布的新软件“XE Pro” 和 “IG Master”，正如制造商声称的使得早幼粒细胞、中幼粒细胞和晚幼粒细胞计数变得简单、快速、便宜，并将这些细胞归并入“幼稚粒细胞计数”。幼稚粒细胞值报告两种数值绝对值和占白细胞的百分比。汉堡Barmbek General医院（一家700张床位的教学医院）根据NCCLS的H20-A规定，对XE-2100“幼稚粒细胞计数”与显微镜方法的一致性、准确性和重复性进行评估。此外也做了XE-2100 IG
血标本选择和处理
在6周的工作日内对所有参与试验血标本的白细胞分类进行了筛选。挑选的血标本是在Sysmex XE-2100上初次测试幼稚粒细胞值>0.1
3×10 /µL。所有样本都加入2.8mL EDTA-K3。这项试验也包括重复样本（一个病人在不同的时候的标本）。NCCLS的H20-A规定白细胞分类计数必须参考显微镜方法。血液室接到血标本后，同一标本制作3份血涂片(A, B, C)，在90分钟内完成。
显微镜方法
血涂片用May-Grünwald-Giemsa染色，两个技术人员各完成血涂片A和B 200个细胞分类（共400个细胞）。当A和B的结果发生差异时，观察备用的血涂片C。执行显微镜检查的血液学技术人员必须经过特别训练富有经验，并通过NCCLS H20-A规定的资格考试。
Sysmex Journal International Vol.12 No.2(2002)
血涂片A和B的200个细胞分类以NCCLS H20-A 制定的百分比值的可信度来评估它的重复性。当可信度低于95%时再对血涂片C进行评估。由此计算出中性粒细胞、淋巴细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞和幼稚粒细胞的可信度以此作为显微镜方法质量和准确度的判断指标。出现有核红细胞时，要对白细胞的计数进行修正。原始淋巴细胞，幼淋巴细胞均被当作淋巴细胞计数。
XE-2100 IG Master 软件
XE-2100 血液分析仪(日本神户Sysmex公司)软件版本00-20是XE Pro版本00-03和XE IG Master软件版本00-03的升级板。上述两者都作为现有的XE-2100软件的插件程序，并可商业应用。XE Pro是可以安装其他模组软件的平台软件。XE IG Master 是其中一个模组软件。标准的XE-2100 提供的幼稚粒细胞计数只是作为一个研究参数，而安装了IG Master模组软件后就可以报告这个参数。
XE IG Master运用了新开发的计算规则，在白细胞分类通道中用自动阈值鉴别线把幼稚粒细胞从成熟粒细胞中自动区分出来。白细胞用STROMATOLYSER-4DS染色，这种聚次甲基染料可以进入细胞使RNA和DNA着色。幼稚粒细胞的DNA比成熟的粒细胞多，通常有着较强的荧光信号，能够被光电倍增器检测到。白细胞的内部复杂性用90度散射光进行检测，两种信号均在白细胞分类散射图显示, 可适性簇分析系统（ACAS，日本神户Sysmex公司）可以把白细胞分为几个亚群。幼稚粒细胞自动阈值鉴别线所报告的幼稚粒细胞的计数显示在XE-2100主屏幕上并传送到主机接口。在白细胞分类通道中幼稚粒细胞群被标记成深蓝色，因此很容易与标记成浅蓝色的成熟粒细胞群区别开来。（图1）“e-check” 质控血用作幼稚粒细胞质控。
图1.白细胞分类通道散射图
注 :幼稚粒细胞标成深蓝色，中性粒细胞和杆状核染成浅蓝色
用不同幼稚粒细胞含量的临床血标本进行重复性测定。两个小时内每个样本重复测定3-8次(视标本量)，血液分析仪不要连续地测定同一标本，其间穿插其他标本的检测。由此获得的重复性远比批内精密度更有说服力，由此计算得到的SD和CV值与幼稚粒细胞的数量成反比。
统计学分析
在Excel工作表中输入原始数据作线性回归和相关性的统计学分析。所有手工计数值均采用400个细胞分类的百分比值((A+B)/4), 而绝对值则再乘以XE-2100的白细胞总数。
结果
258例样本最初要符合试验的标准（如幼稚粒细
胞计数0.1×10/µL），这就意味着这期间所有分类只有5%到25%符合要求(平均每天10%)。247例样本有完整的数据，符合NCCLS H20-A品质标准, 所以纳入显微镜方法数据。由于两个技术人员的结果有一个或几个细胞群的分类未达到可信度范围，其中7例样本进行显微镜重新评估。只有1例样本由于细胞形态异常，再次计数后仍被剔除。因此一共有246例样本进行了以下的统计学分析
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显微镜方法的批内差异
每份标本由两个技术人员对不同血涂片各自进行200个细胞分类。相关系数为中性粒细胞r=0.974、淋巴细胞r=0.970、单核细胞r=0.855、嗜酸性粒细胞r=0.952。嗜碱性粒细胞相关性差，没有线性回归。杆状核(r=0.874)和幼稚粒细胞(r=0.803)相关系数略高，由于多变的细胞形态，这个批内差异是允许的。
XE-2100细胞五分类和显微镜方法的相关性 XE-2100和显微镜方法对常规的细胞分类比较的结果很好。显微镜的结果是综合400个细胞的分类。显微镜的计数通过分类的百分比乘以XE-2100的白细胞总数转换为绝对值。图3显示了中性粒细胞(r=0.996)、淋巴细胞(r=0.969, 对一个慢淋的患者XE-2100测得淋巴细胞总数去
掉一个极端值后为195.4 103 /µL，显微镜值为191.2103 /µL)、嗜酸性粒细胞(r=0.986)，均具有好的相关性。嗜碱性粒细胞没有线性回归，图中没有显示统计学数据。单核细胞的相关系数好(r=0.910)。单核细胞线性回归的斜率是b=1.300，反映了众所周知现象，即血液分析仪的单核细胞测定值比显微镜方法高。
XE-2100 幼稚粒细胞计数与显微镜方法的相关性
幼稚粒细胞在显微镜方法中定义为早幼粒细胞、中幼粒细胞和晚幼粒细胞，不包括杆状核和原始细胞。XE-2100和显微镜方法对于幼稚粒细胞的绝对值(r=0.900)和百分比(r=0.871)都显示好的相关性（图4）。XE-2100报告的幼稚粒细胞数斜率为1.153，略高于显微镜值。
图2a.A和B显微镜计数的相关性
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图2b.A和B显微镜计数的相关性
XE-2100对婴幼儿的幼稚粒细胞计数与显微镜方法的相关性比较
婴幼儿的血样本通常含有多样的幼稚粒细胞形态，经常需要人工分类。对本试验样本中的小部分婴幼儿的血样本分析(24例;年龄0-33天)在显微镜方法中显示了明显降低的批内相关性(r=0.529)，但是显微镜方法的综合结果与XE-2100幼稚粒细胞的结果有良好的相关性(r=0.884)(图6和7)。246例幼稚粒细胞报告中的72例被IG Master软件标上了*号。*号提示报告的值由于样本的特殊情况导致可信度低，例如异常的散射图、特别高或特别低的白细胞总数或者是异常的细胞形态。对XE-2100幼稚粒细胞值依据有没有*号作了分别的分析（见图5），而二种情况与显微镜方法相关性没有明显差异(r=0.881和r=0.868).值得关注的是一些幼稚粒细胞值高的样本往往被标上*号（标上*号的幼稚粒细胞3均值为0.612×10 /µL，未标上*号的幼稚粒细3胞均值为 0.265×10 /µL）。
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图3.XE-2100和显微镜方法的绝对值比较
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图4 XE-2100和显微镜方法幼稚粒细胞绝对值比较
图5 XE-2100标记*号和没有标记*号的幼稚粒细胞绝对值和显微镜方法比较
图6 新生儿样本：技术人员A和B 显微镜幼稚粒细胞计数
图7 新生儿样本：XE-2100和显微镜方法
幼稚粒细胞绝对值比较
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图8 幼稚粒细胞计数的精密度(CV和SD)的主观因素降到最低，提供有统计学意义的数据。对一个样本两个镜检值的分析显示了中性粒细胞、淋巴细胞、嗜酸性粒细胞、嗜碱性粒细胞观察者之间很小的差异，对于象幼稚粒细胞，单核细胞和杆状核细胞这些具有多种形态的细胞群，它的相关系数不得不期望要低一点，但是仍就很好。这就揭示了技术人员对显微镜参考计数有好的可靠性和稳定性。
XE-2100与显微镜相比五分类的结果很好(见图 3)。大部分全自动血液分析仪的单核细胞的测定值比显微镜值都略微高一点。因而在某些单位，血液分析仪和显微镜方法有各自的单核细胞参考范围。由于嗜碱性粒细胞的相对值和绝对值很小所以它的统计学特性差，但是它的相关性系数还是令人满意的。
图9 幼稚粒细胞计数的重复性(幼稚粒细胞重复测
我们的试验结果证实以前的研究，Sysmex 定值
XE-2100全自动血液分析仪的白细胞五分类的和样本幼稚粒细胞均值)
结果是很好的。
重复性
表1显示了所有细胞群的线性回归。
日常使用一年后需要对血液分析仪作精密度测定，不需要特殊的调试或者校准。年度保养一周后，作精密度测定。用不同浓度的幼稚粒细胞样本两小时内作重复性测定（不能做连续测定）。视样本量对仪器作3-10次的重复测定。结果显示在图8中。考虑到幼稚粒细胞的绝对值较低，CV和SD显示的差异合理。重复性检测的结果与幼稚粒细胞的均值呈反比，结果见图9。
讨论
外周血中继杆状核之后，出现一定量的幼稚细胞是病人发生感染的重要信息，但是至今为至这个信息只能靠显微镜方法获得。这是一个批内差异大，费时，劳动强度大的工作。这项试验的目的是检测新推出的SYSMEX XE-2100幼稚粒细胞计数质量与传统显微镜方法相比较。显微镜方法是根据NCCLS H20-A 将检测者
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表 1 XE-2100白细胞分类和显微镜方法400个细胞分类比较
绝对值
细胞类型 相关系数 斜率 截距
NEUT# 0.996 0.990 0.075 LYMPH# 0.969 0.996 0.050 EO# 0.986 0.986 0.004 BASO# 0.674-MONO% 0.875 1.273 0.580 IG% 0.871 1.200
0.200
来没有影响幼稚粒细胞实际计数的可靠性。许多标上*号的结果可以安全地报告给临床。Sysmex公司现在承诺一个关系幼稚粒细胞计数的*号规则修订版。
单有杆状核升高的临床意义现在在争论中（在德国，升高提示核左移）。XE-2100没有单独报告杆状核值，其大部分归入了中性粒细胞，中性粒细胞的值与显微镜方法中中性粒细胞加杆状核的值一致。显微镜方法中杆状核的计数即使运用了同一个形态学标准，在实验者之间和实验室之间的值的差异仍然是相当大的（在德国，普遍运用的是“1/3”标准），因此期待一个更可靠稳定的全自动项目（如幼稚粒细胞计数）。
因为Sysmex XE-2100分析仪的IG Master / XE Pro软件技术评估显示全面的良好可靠性和重复性。我们期待这项研究对临床病人的幼稚粒细胞计数检测有用。据我们所知，幼稚粒细胞正常参考值还没有确立。
一旦在临床医疗中建立全自动幼稚粒细胞计数而且被临床接受，那么血样本中即使出现了幼稚粒细胞也不必再进行显微镜检查。这将进一步降低血液实验室的工作量，将时间用到比传统的显微镜方法更有价值的工作中去。部分实验室对新生儿监护室提供了此项服务，这可以提高经济效益。
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感谢
Sysmex 欧洲公司慷慨地提供了“XE Pro” 和 “IG Master” 软件包。感谢Kristina Begemann、Julia Kulin、Birte Walter、Andrea Schmidt、Ulrike Pohl、Sabine Zörner和Brigitte Heitmann-Thiede参与显微镜计数工作。
参考书目
1)Briggs C, et al.: Performance evaluation of
the Sysmex XE-2100.Sysmex J Int, 9 : 113-119, 1999.2)National Committee for Clinical Laboratory Standards(NCCLS):
Reference leukocyte differential count(Proportional)and evalua-
tion of instrumental methods, NCCLS document H20-A, Vol.12(1), 1992.3)Herklotz R, Huber AR : Precision and accuracy of the leukocyte
differential on the Sysmex XE-2100.Sysmex J Int, 11 : 8-21, 2001.
