考马斯亮蓝染色法显示细胞骨架
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细胞生物学实验
考马斯亮蓝染色法显示细胞骨架
一、实验目的a)掌握细胞骨架的特点及在细胞中的基本位置。b)掌握考马斯亮蓝染色法观察细胞骨架。
c)了解各种试剂在细胞骨架染色观察中的作用。
二、实验原理
细胞骨架（cytoskeleton）是细胞内以蛋白纤维为主要成分的网络结构。广义的细胞骨架包括细胞核骨架、细胞质骨架、细胞膜骨架和细胞外基质，狭义的细胞骨架是指细胞质骨架，包括微管（microtubule,MT）、微丝（microfilament,MF）和中间纤维（intermediated filament,IF）。
微管是细胞内由微管蛋白形成的直径约20~26nm的长度不一的小管。分布在核周围，呈放射状向胞质四周扩散，主要确定膜性细胞器的位置和作为膜泡运输的导管。微管蛋白有α和β 两种。α β异二聚体沿纵向聚合成丝，原丝成环状排列形成微管的壁。微管不稳定，对低温（冷冻）、高压等物理因素及秋水仙素（微管断裂剂）等化学因素敏感。紫杉醇可以和微管蛋白多聚体结合，抑制微管解聚。
微丝在真核细胞内主要由肌动蛋白（actin）组成的直径为5～7nm的骨架纤丝。主要分布在细胞质膜的内侧，作用是确定细胞表面特征、并与细胞运动、收缩、内吞等功能有关。脊椎动物肌动蛋白分为α、β和γ三种类型，不同种类细胞中肌动蛋白组成不同。肌动蛋白单体为球形，依次连接成链，两串肌动蛋白链互相缠绕扭曲成一股微丝。细胞松弛素B为微丝断裂剂。
中间纤维是直径介于微丝和微管之间（7~11nm）、由多种不同蛋白组成的细胞骨架成分。在细胞中围绕着细胞核分布，成束成网，并扩展到细胞质膜，与质膜骨架相连结。主要起机械支撑和加固作用。中间纤维在不同细胞中的蛋白组成不同，可用于鉴定肿瘤细胞来源。
细胞骨架在细胞形态维持、细胞运动、物质运输、能量转换、信息传递、细胞分裂等一系列方面均有重要作用，所以对于细胞骨架的研究是近代细胞生物学最活跃的研究领域之一。由于细胞骨架易受各种理化因素的影响而发生形态变化，细胞骨架也常作为目标研究环境温度、放射线、重金属、致癌剂及抗癌药物等对细胞的影响。
显示细胞骨架的常用方法有两种：考马斯亮蓝染色法和免疫荧光染色法。考马斯亮蓝染色法具有简单易行的特点，但不能区分骨架蛋白的组成，仅能用于骨架形态及完整性研究；免疫荧光染色法可特异显示骨架蛋白，具有更普遍的应用意义。
用去垢剂Triton-X-100处理细胞，可以溶解膜脂，并与大部分非骨架蛋白疏水区结合而将其溶解掉，剩下细胞骨架系统的蛋白不被溶解掉，然后用蛋白染料考马斯亮蓝染色即可显示骨架结构。
三、实验仪器及试剂
a)实验材料
洋葱鳞茎内表皮
细胞生物学实验
b)实验试剂
i.M缓冲液，配方：
1.咪唑50mmol/L，2.KCl 50mmol/L，3.MgCl2 0.5mmol/L，4.EGTA 1mmol/L，5.EDTA 0.1 mmol/L，6.巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）1mmol/L。（用1 mol/L盐酸调pH至7.2。）
ii.6mmol/L(pH6.8)磷酸缓冲液，用NaHCO3调其pH。iii.1%Triton X-100：用M缓冲液配。
iv.0.2%的考马斯亮蓝R250染液。其溶剂为：
1.乙醇46.5ml 2.冰醋酸7ml 3.蒸馏水46.5ml c)实验仪器
显微镜、1.5 ml eppendorf管、刀片等。
四、实验步骤
a)撕取洋葱鳞茎内表皮若干片，大小约0.5cm*0.5cm，放入盛有1ml PBS（Ph6.8）的eppendorf管中，静置2-3min,使PBS完全浸透。b)吸去缓冲液，用1ml1%Triton X-100处理标本20min。
c)吸去Triton X-100，用M缓冲液漂洗标本3次，每次静置5min。d)加固定液固定30min。
e)用PBS洗涤3次，每次静置5min。f)弃PBS，滤纸吸除残留液体。
g)用0.2%的考马斯亮蓝R250染色10min。h)用蒸馏水洗数次，降低背景。
i)将样品置于载玻片上，加盖玻片，在光学显微镜下观察。
（另外，需要做两个对照组，一个b）、c)不做；另外一个c)不做。对比三个的差别。）
五、实验结果
a)不做b)、c)两步的观察结果
如上图所示，在不用去垢剂的情况下，细胞中的蛋白质都会被考马斯亮蓝染上色。箭头1所指的为细胞壁，其被考马斯亮蓝染上明显的蓝色，细胞生物学实验
故其上有大量蛋白。箭头2所指的，为细胞质当中被染成蓝色的泡状物质，为细胞质中大量的蛋白质。箭头3所指的为被染色的细胞核。b)不做c)的观察结果
如上图所示，因为用了去垢剂处理，可以溶解膜脂，并与大部分非骨架蛋白疏水区结合而将其溶解掉，剩下细胞骨架系统的蛋白不被溶解掉。所以箭头1所示的细胞膜处的蛋白质及糖蛋白等已被溶解故考马斯亮蓝在1处无法染色，与a)中图相比细胞膜处的蓝色消失。但又没有用M缓冲液进行漂洗，所以如箭头2所示，细胞质当中基本被已经溶解的可溶性蛋白质小泡充满。c)所有步骤都做的观察结果
如上图所示，在用去垢剂溶解可溶性蛋白质，并用M缓冲液漂洗以后，可溶性蛋白质被除去，即与b)图中相比，细胞质中的颜色明显淡了很多。细胞中被考马斯亮蓝染色的即为细胞骨架：微管、微丝、中间纤维。
细胞生物学实验
六、思考题
a)比较用与不用1%TritonX-100处理的实验结果。
不用1%TritonX-100处理的细胞内的蛋白质都能被考马斯亮蓝染上色。而用1%TritonX-100处理的细胞，细胞当中的可溶性蛋白都被1%TritonX-100溶解掉，细胞膜上的蛋白质和糖蛋白都溶解掉，细胞当中能被考马斯亮蓝染上色的只剩下细胞骨架。
b)查阅资料说明M-缓冲液中咪唑、MgCL2、EGTA、EDTA、巯基乙醇或二硫苏糖醇（DTT）在稳定细胞骨架中的作用。i.咪唑：稳定PH值，缓冲作用。
ii.KCL：提供离子，对骨架起聚合作用。iii.MgCL2:提供离子，对骨架起聚合作用。iv.EGTA：螯合Ca离子 Ca离子对聚合不利。v.EDTA：螯合Ca离子 Ca离子对聚合不利。vi.巯基乙醇：起还原作用，稳定骨架结构。c)设计检测微丝的间接免疫荧光法实验流程。
i.撕取洋葱鳞茎内表皮，放入eppendorf管中。ii.用10%中性福尔马林固定20min。iii.用PBS洗3次，每次5min。
iv.室温下浸于0.5%TritonX-100内作用20min。v.用预温至37℃的PBS洗3次，每次5min。
vi.加FITC标记的抗微丝蛋白抗体反应：向细胞标本滴加约50L稀释好的标记抗体溶液，放于人工湿盒内，37℃避光反应45min。
vii.用PBS洗3次，每次5min。
viii.将洋葱鳞茎内表皮从eppendorf管中取出，在载玻片上展平。ix.封片置荧光显微镜或激光共聚焦显微镜下观察。微丝呈现绿色。
d)注意事项
a)防止洋葱鳞茎内表皮卷曲、折叠。b)TritonX-100处理时间应足够，处理完洗涤应充分，否则胞内会存在膜泡状结构及其它杂蛋白，干扰骨架染色及观察。c)TritonX-100处理后各步操作应轻柔，避免容器剧烈震荡及吸管吹打过猛引起骨架蛋白束断裂。
